Name: selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00
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Cette étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (GM071440 au CH et NS051630/MH076090/MH078972 à PJ).

1. La fragmentation ADN génomique Fragment d&#39;ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l&#39;ADN génomique fragmenté sur gel d&#39;agarose 1% (Figure 1). 2. Préparation de l&#39;ADN Déterminer les quantités d&#39;ADN à partir basées sur...

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. 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5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l&#3...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M pH 8,0 acide éthylène diamine (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma de base (Tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-biotine conjugué Peg3- </td><td> Cliquez sur Outils Chimie </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-dithiothréitol, ultrapure (TNT) suprapur </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick suppression de nucléotides </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Colonne </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen PCR Purification Kit MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucose </td><td> Active Motif </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzyme </td></tr><tr><td> β-glucosyltransférase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Dispositif de sonication </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse bureau </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Appareil de gel running </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pied de séparation magnétique </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 fluorimètre </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 10 Configuration réactif X β-GT tampon de réaction (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X à relier et de lavage (B &amp; W) tampon (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, 0,02% de Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l&#39;ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l&#39;expression des gènes, le maintien de l&#39;intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer 1. Récemment, la présence d&#39;un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales 2-4. 5-HMC est généré par l&#39;oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases 2, 3. 5-HMC est proposé de participer à l&#39;entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote 2, 5-10. Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC 11 </sup&gt;. Pour élucider la biologie de la 5-HMC, nous avons développé une approche chimique très efficace et sélective d&#39;étiqueter et de capturer 5-HMC, profitant d&#39;une enzyme bactériophage qui ajoute une fraction de glucose à 5 HMC spécifiquement 12. Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l&#39;étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l&#39;ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d&#39;une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l&#39; modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l&#39;étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l&#39;étiquetage quelle que soit l&#39;abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d&#39;ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d&#39;une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d&#39;ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération. Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d&#39;ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d&#39;une seule base de 5-HMC.

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Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l&#39;aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l&#39;enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d&#39;étiquetage efficace et spécifique permet l&#39;enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

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