Name: selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM071440 לCH וNS051630/MH076090/MH078972 לPJ).

1. פיצול הדנ&quot;א הגנומי הדנ&quot;א הגנומי בר באמצעות sonication לטווח גודל רצוי מתאים לפלטפורמת רצף הגנום כולו. (בדרך כלל אנחנו sonicate ל ~ 300 נ&quot;ב.) ודא התפלגות הגודל של הדנ&quot;א הגנומי המקוטע ב% agarose ג&#39;ל 1 (1 איור). <p class="jove_t...

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) הוא הווה שינוי epigenetic זיהה לאחרונה בכמויות ניכרות בסוגי תאי יונקים מסוימים. השיטה שהוצגה כאן היא לקביעת חלוקת הגנום של 5-HMC. אנו משתמשים bacteriophage T4 β-glucosyltransferase להעביר מחצית גלוקוז מהונדסת המכילה קבוצה תזיד על קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC. הקבוצה תזיד יכולה לה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> הערה </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> נתרן כלורי 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת ethylenediaminetetraacetic pH8.0 0.5m (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma בסיס (טריס) pH7.5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530 </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמא </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> 20 Tween </td><td> BioReagents הפישר </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-ביוטין הצמוד </td><td> לחץ על כלי כימיה </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> ערכה להסרת נוקלאוטיד QIAquick </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> מייקרו יו ספין 6 טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ערכת טיהור PCR MinElute Qiagen </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-3-N גלוקוז </td><td> מוטיב פעיל </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> אנזים </td></tr><tr><td> β-glucosyltransferase (β-GT) </td><td> ניו אינגלנד Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מכשיר sonication </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה שולחן העבודה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אמבט מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מנגנון פועל ג&#39;ל </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube אכר </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube אכר </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סטנד הפרדה מגנטי </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> קיוביט 2.0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> התקנת מגיב 10 X תגובת β-GT מאגר (500 HEPES המ&quot;מ pH 7.9, 250 מ&quot;מ MgCl 2) 2 X עקידה וכביסת חיץ (B &amp; W) (10 mM טריס pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% 20 Tween) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-methylcytosine (5-MC) מהווה ~ 2-8% מכלל cytosines בהדנ&quot;א הגנומי אדם ומשפיע על מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ביטוי גנים, שמירה על שלמות הגנום, החתמה הורית, איון כרומוזום ה-X, רגולציה של פיתוח, הזדקנות וסרטן 1. לאחרונה, הנוכחות של חומץ 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), התגלתה בתאי יונקים, ובעיקר בתאי גזע עובריים (ES) ותאים עצביים 2-4. 5-HMC נוצר על ידי חמצון של 5-MC קטליזאטור ידי ט משפחת הברזל (ב &#39;) / dioxygenases α-ketoglutarate התלוי 2, 3. 5-HMC מוצע להיות מעורב בתחזוקה של תא גזע עוברי (MES), hematopoiesis וממאירויות הרגילים, והזיגוטה פיתוח 2, 5-10. כדי להבין טוב יותר את התפקוד של 5-HMC, מערכת רצף אמינה וישירה היא חיונית. רצף יסולפיט מסורתי לא מבחין בין 5-5-HMC מMC 11 </sup&gt;. כדי להסביר את הביולוגיה של 5-HMC, פתח גישה כימית יעילה מאוד סלקטיבית לתייג וללכוד 5-HMC, תוך ניצול של אנזים bacteriophage שמוסיף מחצית סוכר ל5-HMC במיוחד 12. כאן אנו מתארים הליך פשוט שני שלבים לתיוג כימי סלקטיבית של 5-HMC. בשלב התיוג 1, 5-HMC בהדנ&quot;א הגנומי מתויג עם קטליזאטור 6-יזיד-גלוקוז על ידי β-GT, glucosyltransferase מbacteriophage T4, באופן שמעביר את 6-תזיד-גלוקוז ל5-HMC מ העדכון cofactor, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). בצעד, biotinylation השני, מקשר ביוטין דיסולפיד מצורף לקבוצה יזיד ידי לחץ כימיה. שני פעולות ספציפיות ויעילות ביותר, שמובילות לתיוג להשלים ללא קשר לשפע של 5-HMC באזורים גנטיים ונותנים רקע נמוך ביותר. בעקבות biotinylation של 5-HMC, שברי 5-DNA המכיל HMC אז הם כבשו סלקטיביבאמצעות חרוזי streptavidin באופן עצמאי בצפיפות. שברי 5-HMC מועשרי DNA המתקבלים יכולים לשמש עבור ניתוחים במורד זרם, כוללים רצף של הדור הבא. התיוג סלקטיבית שלנו ופרוטוקול לכידה מקנים רגישות גבוהה, החלה על כל מקור של הדנ&quot;א הגנומי עם שכיחות משתנית / 5-HMC מגוון. אמנם המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא יישומה במורד הזרם (כלומר., הדור הבא של רצף למפות את התפלגות 5-HMC בגנום), זה תואם עם מולקולה בודדה, SMRT (DNA) רצף בזמן אמת, שהוא מסוגל לספק רזולוצית רצף יחיד בסיס של 5-HMC.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...