Name: selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00
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この研究は、米国国立衛生研究所（CHとNS051630/MH076090/MH078972にPJにGM071440）によって部分的にサポートされていました。

1。ゲノムDNAの断片化ゲノムワイドなシーケンシングプラットフォームに適した所望のサイズ範囲に超音波処理を用いてゲノムDNA断片。 （私達は通常〜300 bpまで超音波処理。）を1％アガロースゲル（ 図1）上の断片化したゲノムDNAのサイズ分布を確認します。 2。 DNAの調製ゲノムDNA中の5-HMCの豊富に基づく出発DNAの量を...

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. 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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. 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U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. 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5 - ヒドロキシメチル（5 - HMC）は、特定の哺乳類の細胞型における実質的な量で最近同定されたエピジェネティックな修飾の存在しています。ここで紹介する方法は、5 - HMCのゲノムワイドな分布を決定するためのものです。我々は5-HMCのヒドロキシル基にアジド基を含有する人工グルコース部分を転送するために、β-グルコシルT4バクテリオファージを使用しています。アジド基を化学的...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> 5M塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>プロメガ</td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M pH8.0エチレンジアミン四酢酸（EDTA） </td><td>プロメガ</td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1Mトリズマベース（トリス）pH7.5 </td><td>インビトロジェン</td><td> 15567-027） </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M、pH7.4の</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> 1M塩化マグネシウム（MgCl 2） </td><td>アンビオン</td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ</td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>フィッシャーBioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3 - ビオチンコンジュゲート</td><td>化学ツール]をクリックし</td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4 - ジチオスレイトール、超純（DTT）の超純粋な</td><td>インビトロジェン</td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAクイックヌクレオチド除去キット</td><td>キアゲン</td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロバイオスピンカラム6 </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td>ダイナMyOne </td><td>インビトロジェン</td><td> 650から01 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンC1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キアゲンMinElute PCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-グルコース</td><td>アクティブモティ</td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 酵素 </td></tr><tr><td> （β-GT）は、β-グルコ</td><td>ニューイングランドBiolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>超音波処理装置</td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td>デスクトップの遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルランニング装置</td><td>バイオ·ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquakeチューブシェーカー</td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquakeチューブシェーカー</td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気分離スタンド</td><td>プロメガ</td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td>量子ビット2.0蛍光計</td><td>インビトロジェン</td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬のセットアップ 10 Xのβ-GTの反応緩衝液（500mMのHEPES pHは7.9、250 mMのMgCl 2）2 X結合および洗浄（B＆W）緩衝液（10mMトリス（pH7.5）、1mMのEDTA、2MのNaCl、0.02％Tween 20）で。 </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5 - メチルシトシン（5-MC）は、ヒトのゲノムDNAの総シトシン〜2から8パーセントを構成しており、遺伝子発現、ゲノムの完全性の維持、親の刷り込み、X染色体不活性化の調節を含む生物学的機能の広い範囲に影響を与え発達、老化、癌1。最近では、酸化された5-MC、5 -ヒドロキシメチル（5 - HMC）の存在は、胚性幹（ES）細胞および神経細胞2-4の、特に哺乳動物細胞内で発見されました。 5-HMCは、TETファミリー鉄（II）/α-ケトグルタル酸依存オキシゲナーゼ2、3、5-MC触媒作用の酸化によって生成されます。 5-HMCは胚性幹（MES）細胞、正常な造血及び悪性腫瘍、および受精卵開発2、5月10日の維持に関与することが提案されている。良い5-HMCの機能を理解するために、信頼性が高く、簡単なシーケンシングシステムが不可欠です。従来のバイサルファイトシークエンシングは5-MC 11から5-HMCを区別することはできません</sup&gt;。 5-HMCの生態を解明するために、我々は具体的には5-HMCに12グルコース部分を追加したバクテリオファージ酵素を利用して、ラベルと5-HMCをキャプチャするための非常に効率的かつ選択的な化学的なアプローチを開発しました。 ここでは5-HMCの選択的化学標識するための簡単​​な2ステップの手順を説明します。第一の標識のステップでは、ゲノムDNA中の5 - HMCは、5 - HMCに6 - アジド-グルコースを転送する方法では、β-GTは、バクテリオファージT4からグルコシルトランスフェラーゼによる6 - アジド-グルコースで触媒で標識されている修正された補因子は、UDP-6-N3-GLC（6 N3UDPG）。第二段階、ビオチン化では、ジスルフィドビオチンリンカーをクリックケミストリーによりアジド基に装着されている。両方の手順は、ゲノム領域における5-HMCの豊富さに関わらず、ラベリングと非常に低いバックグラウンドを与えて完成につながる、非常に特異的かつ効率的である。 5-HMCのビオチン化に続いて、5-HMCを含むDNA断片を選択的に捕獲される密度に依存しない方法でストレプトアビジンビーズを使用。得られた5-HMC-濃縮したDNA断片を、次世代シーケンシングを含む下流の分析、を使用することができる。 私たちの選択的標識とキャプチャプロトコルは、変数/多様な5-HMCの存在量を用いたゲノムDNAの任意のソースに適用し、高感度を与える。このプロトコルの主な目的は、その下流のアプリケーション（ すなわち 。、次世代シーケンシングは、ゲノム中の5-HMC分布をマップアウトする）ですが、それは単一分子であり、リアルタイムSMRT（DNA）の配列決定、と互換性があります5-HMCの単一塩基解像度のシーケンシングを提供することができる。

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Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ（β-GT）を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

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