Name: selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Это исследование было частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM071440 в CH и NS051630/MH076090/MH078972 к PJ).

1. Геномной ДНК фрагментации Фрагмент геномной ДНК с использованием ультразвука до нужного размера диапазона подходит для генома последовательности платформы. (Мы обычно разрушать ультразвуком до ~ 300 б.п.). Убедитесь, распределение по размерам фрагментированной геномно?...

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) является недавно идентифицированных эпигенетической модификацией настоящего в значительных количествах в определенных типах клеток млекопитающих. Метод, представленный здесь для определения генома распределение 5-HMC. Мы используем бактериофага Т4 β-glucosyltransferase пере?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Имя </td><td> Компания </td><td> Каталог # </td><td> Комментировать </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Реагенты </td></tr><tr><td> 5M хлорида натрия (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 М рН 8,0 этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma базы (Трис) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорид магния (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530g </td><td></td></tr><tr><td> Диметилсульфоксид (ДМСО) </td><td> Сигма </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Фишер BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-биотин сопряженных </td><td> Нажмите химия Инструменты </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Dithiothreitol, сверхчистых (DTT) сверхчистого </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick нуклеотидных Kit Удаление </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 колонка </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Стрептавидин C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute ПЦР Очистка Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Агароза </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-глюкозы </td><td> Активный Motif </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Фермент </td></tr><tr><td> β-glucosyltransferase (β-GT) </td><td> Новая Англия Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Оборудование </td></tr><tr><td> Озвучивание устройства </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Обои для рабочего центрифуги </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Водяная баня </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Гель работает аппарат </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake труб Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake труб Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Магнитная стойка Разделение </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Кубит 2,0 Флуорометр </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Реагент установки 10 X β-GT Реакция буфера (500 мМ HEPES рН 7,9, 250 мМ MgCl 2) 2 X Переплет и стиральные (B &amp; W) буфера (10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2 М NaCl, 0,02% Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-метилцитозин (5-MC) составляет ~ 2-8% от общего цитозина в геномной ДНК человека и влияет на широкий спектр биологических функций, включая экспрессию генов, поддержание целостности генома, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, регуляция развития, старения и рака 1. В последнее время в присутствии окисленного 5-тС, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), был обнаружен в клетках млекопитающих, в частности, в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и нервных клеток 2-4. 5-HMC образуется при окислении 5-тС катализируемой ТЕТ семьи железа (II) / α-КГ-зависимых диоксигеназ 2, 3. 5-HMC предлагается принять участие в поддержании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) клетки, нормального кроветворения и злокачественных новообразований, а также развития зиготы 2, 5-10. Чтобы лучше понять функции 5-HMC, надежный и простой последовательности системы имеет важное значение. Традиционная последовательность бисульфита не могут отличить 5-HMC из 5-тС 11 </sup&gt;. Чтобы распутать биологии 5-HMC, мы разработали высокоэффективные и селективные химические подход к маркировке и захват 5-HMC, пользуясь бактериофага фермент, который добавляет глюкозу группы к 5-HMC конкретно 12. Здесь мы опишем простой двухэтапной процедуры для селективного маркировки химической 5-HMC. На первом этапе маркировки, 5-HMC в геномной ДНК помечена с 6-азид-глюкозы, катализируемой β-GT, glucosyltransferase из бактериофага Т4, таким образом, что переводит 6-азид-глюкозы до 5-HMC из Изменения кофактора, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). На втором этапе, биотинилирование, линкер дисульфида биотин прикреплен к азид группу, нажав на кнопку химии. Оба шага весьма конкретные и эффективные, ведущие к полному маркировке независимо от обилия 5-HMC в геномных регионов и дает крайне низкий фон. После биотинилирования 5-HMC, 5-HMC-содержащих фрагменты ДНК затем выборочно захваченныеиспользованием стрептавидина бусы в плотности независимым образом. Полученный 5-HMC-обогащенного фрагменты ДНК могут быть использованы для последующего анализа, в том числе следующего поколения секвенирования. Наш избирательный маркировки и захват протокол дает высокую чувствительность, применимы к любому источнику геномной ДНК с переменным / разнообразна 5-HMC содержания. Хотя основной целью этого протокола является его вниз по течению приложений (например,. Следующего поколения секвенирования, чтобы наметить 5-HMC распределение в геноме), она совместима с одной молекулой, в режиме реального времени SMRT (ДНК) последовательность, которая является способные доставлять одной базе резолюции последовательности 5-HMC.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Описывается два шага маркировки процесса с использованием β-glucosyltransferase (β-GT), чтобы передать азид-глюкозы до 5-HMC, а затем нажмите химия для передачи биотин компоновщика для легкой и плотности независимых обогащения. Это эффективный и конкретный маркировки метод позволяет обогащению 5-HMC с крайне низким фоном и высокой пропускной эпигеномном отображения с помощью следующего поколения секвенирования.

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Удлинения праймера Capture: Целевые поиска последовательностей из сильно деградированных Источники ДНК

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Упрощенная очистка плазмидной ДНК из Прокариотические культур

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Геномная МРТ - общественный ресурс для изучения последовательности Шаблоны в геномной ДНК

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Добыча высокомолекулярных ДНК Вес от микробных матах

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Выявление редких геномных вариантов с помощью секвенирования Объединенные SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Практические и новый метод для извлечения геномной ДНК из крови Комплекты Коллекция по сохранению белков плазмы

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...