Name: selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health (GM071440 till CH och NS051630/MH076090/MH078972 PJ).

1. Genomiskt DNA Fragmentering Fragment genomiskt DNA med användning av sonikering i ett önskat storleksområde lämpad för genomet hela sekvensering plattform. (Vi brukar sonikera till ~ 300 bp). Kontrollera storleken fördelningen av fragmenterade genomiska DNA på 1% agarosgel (figur 1). 2. DNA-preparation Bestäm utgångspunkterna DNA mängder baserat på det överflöd av 5-HMC i genomisk DNA. Eftersom 5-HMC varie...

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) är en nyligen identifierad epigenetiska modifiering föreligger i väsentliga mängder i vissa däggdjurscelltyper. Den metod som presenteras här är för att bestämma genomet bred distribution av 5-HMC. Vi använder T4 bakteriofag β-glukosyltransferas att överföra en manipulerad glukosenhet innehållande en azidgrupp till hydroxylgruppen av 5-HMC. Azidgruppen kan modifieras kemiskt med biotin för detektering, affinitetsanrikning och sekvensering av 5-HMC-innehållande DNA-fragment...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Företag </td><td> Katalog # </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> 5M Natriumklorid (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M pH 8,0 Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma-bas (tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15.630 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530g </td><td></td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher bioreagens </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-biotin-konjugat </td><td> Klicka Kemi Verktyg </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-ditiotreitol, ultrarent (DTT) Superpure </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Nukleotid Borttagning Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 kolonn </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28.004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agaros </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glukos </td><td> Aktiv Motiv </td><td> 55.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzym </td></tr><tr><td> β-glukosyltransferas (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> Ultraljudsbehandling enhet </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desktop centrifug </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vattenbad </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel kör apparater </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetisk separation Stand </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens inställning 10 X β-GT reaktionsbuffert (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM MgCb 2) 2 X Bindning och tvättning (B &amp; W) buffert (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,02% Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-metylcytosin (5-MC) utgör ~ 2-8% av de totala cytosiner i human genomisk DNA och påverkar ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive genuttryck, underhåll av genomet integritet, föräldrarnas prägling, X-kromosom inaktivering, reglering av utveckling, åldrande och cancer 1. Nyligen har närvaron av en oxiderad 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), upptäcktes i däggdjursceller, i synnerhet i embryonala stamceller (ES)-celler och neuronala celler 2-4. 5-HMC alstras genom oxidation av 5-mC katalyserad av TET familjen järn (II) / α-ketoglutarat-beroende dioxygenases 2, 3. 5-HMC föreslås delta i upprätthållandet av embryonala stamceller (MES) cell, normal hematopoes och maligniteter och zygot utveckling 2, 5-10. För att bättre förstå funktionen av 5-HMC, är en tillförlitlig och enkel sekvenseringssystem väsentlig. Traditionell bisulfit sekvensering kan inte skilja 5-HMC från 5-mC 11 </sup&gt;. Att riva upp biologi 5-HMC, har vi utvecklat en mycket effektiv och selektiv kemisk metod att märka och fånga 5-HMC, dra nytta av en bakteriofag enzym som ger en glukosenhet till 5-HMC specifikt 12. Här beskriver vi en enkel två-stegsförfarande för selektiv kemisk märkning av 5-HMC. I det första märkning steget, är 5-HMC i genomiskt DNA märkt med en 6-azid-glukos katalyseras av β-GT, en glukosyltransferas från T4 bakteriofag, på ett sätt som överför 6-azid-glukos till 5-HMC från modifierad cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andra steget, biotinylering, är en disulfid biotin linker fäst till azidgruppen genom att klicka kemi. Båda stegen är mycket specifika och effektiva, vilket leder till fullständig märkning oavsett överflöd av 5-HMC i genomiska regioner och ger extremt låg bakgrund. Efter biotinylering av 5-HMC, de 5-HMC-innehållande DNA-fragment därefter selektivt fångasmed streptavidinpärloma i en täthet-oberoende sätt. De resulterande 5-HMC-anrikade DNA-fragment kan användas för nedströms analyser, inklusive nästa generations sekvensering. Vår selektiva märkning och fånga protokoll ger hög känslighet, som gäller för alla källor av genomiskt DNA med varierande / varierande 5-HMC abundances. Även om det huvudsakliga syftet med detta protokoll är dess nedströms tillämpning (dvs.., Nästa generations sekvensering att kartlägga 5-HMC distribution i genomet), är den kompatibel med enda molekyl, i realtid SMRT (DNA) sekvensering, som är kan leverera enkel-bas upplösning sekvensering av 5-HMC.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA at JoVE.com

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Beskrivs är en tvåstegsprocess märkning med användning β-glukosyltransferas (β-GT) för att överföra en azid-glukos till 5-HMC, följt genom att klicka kemi för att överföra en biotin linker för enkel och densitet oberoende anrikning. Denna effektiva och särskild märkning metod möjliggör anrikning av 5-HMC med extremt låg bakgrund och hög genomströmning epigenomic kartläggning via nästa generations sekvensering.

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Primer Extension Capture: Riktade Sequence hämtning från Kraftigt degraderad DNA Källor

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Generering av RNA / DNA-hybrider i Genomiskt DNA genom omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligonukleotider

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Strömlinjeformad Rening av Plasmid DNA från Prokaryota kulturer

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomic MR - en allmän resurs för att studera Sequence Patterns inom Genomiskt DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Utvinning av hög molekylvikt DNA från Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Detektering av sällsynta genomiska varianter från poolad sekvensering med SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

En praktisk och ny metod att extrahera genomisk DNA från Kits blodinsamling för Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...