Name: preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death
Uploaded: 2012-10-21T14:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato (in parte) con la Israel Science Foundation (Grant 399/11), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nel quadro della convenzione tedesco-israeliano di cooperazione Progetto (DIP), e dall&#39;Istituto famiglia Rappaport per la Ricerca in le scienze mediche.

1. Generazione di linee cellulari inducibili <ol><li> Prima dell&#39;esperimento si ha la necessità di trovare la concentrazione minima del G418 farmaco che uccide le cellule utilizzate per la preparazione delle linee cellulari desiderati. A questo scopo, le cellule piastra di scelta in più piastre duplicati a 70% di confluenza in mezzo che verrà utilizzato durante l&#39;esperimento e aggiungere concentrazioni crescenti di G418 (0-1000 mg per ml). Monitorare le cellule giornalieri per determinare la concentrazione ...

<ol>
	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Knockdown di espressione del gene specifico è un approccio importante per l&#39;indagine del contributo di una proteina a percorsi normativi. Dal momento che knockdown costitutiva di espressione dei geni essenziali influisce negativamente la proliferazione delle cellule, il loro studio hanno bisogno di un introduzione transitoria di siRNA o applicazione di stabili sistemi smontabili condizionali. Generazione di linee cellulari stabili con la capacità di farmaco-indotta espressione di shRNAs qui descritte, fornisce un ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Alta glucosio DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistema approvato FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-REX-293 cellule </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidina </td><td> InvitRogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + plasmide GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Trasfezione PolyPlus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxiciclina </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammiferi è fondamentale per lo studio del contributo di una proteina di interesse per varie vie 1,2. Tuttavia, knockdown condizionale dell&#39;espressione genica è necessaria nei casi in cui knockdown costitutiva non è tollerata dalle cellule per un lungo periodo di tempo 3-5. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di linee cellulari che permettono knockdown condizionale della subunità del fattore ACF rimodellamento della cromatina. Queste linee cellulari facilitare la determinazione del contributo di ACF ad induzione di morte cellulare per la proteina adenovirus E4orf4 6. Sequenze codificanti short hairpin RNA per le subunità ACF1 SNF2h e del fattore di ACF rimodellamento della cromatina sono stati clonati accanto a un doxiciclina promotore inducibile in un plasmide contenente un gene anche per il gene di resistenza alla neomicina. Neomicina resistenti cloni sono stati selezionati in presenza di G418 e isolata. Le linee cellulari risultanti sono state indottetrattamento doxiciclina, e una volta ACF1 o livelli di espressione SNF2h stati ridotti, le cellule sono state transfettate con un plasmide codificante E4orf4 o un vettore vuoto. Per confermare l&#39;effetto specifico dei costrutti shRNA, i livelli di proteina ACF1 o SNF2h sono stati ripristinati ai livelli WT da coinfezione con un plasmide che esprime ACF1 o SNF2h cui erano stati resi resistenti al shRNA con l&#39;introduzione di mutazioni silenti. La capacità di E4orf4 di indurre la morte cellulare nei vari campioni è stata determinata mediante un saggio DAPI, in cui è stata misurata la frequenza della comparsa di nuclei con morfologie apoptotici nella popolazione di cellule transfettate 7-9. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del contributo funzionale di varie proteine ​​di induzione della morte cellulare dai loro partner proteici nei casi in cui knockdown costitutiva può essere letale cellula.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l&#39;uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell&#39;espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Research

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Biology

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Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

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