Name: a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Scott Hamilton, e membros do laboratório O&#39;Halloran para a leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também o nosso revisor anônimo pelos excelentes sugestões e comentários perspicazes.

1. Construção de GFP Tagged EGL-4 Animais Expressando <ol><li> Clonar o traducional fusão GFP :: EGL-4 sob o promotor para o gene odr-3 (2678 pb utilização directamente a montante do codão de iniciação): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. A expressão ODR-3 unidades promotoras nos pares de neurônios amphid: AWA, AWB; AWC, e fracamente em ASH. </li><li> Injectar o plasmídeo (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 do tipo selvagem (em N2) animais aos 50 ng / ul com os marcadores de co-injecção,...

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1.">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575 (2000).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

A entrada odor induzida nuclear de um GFP-tagged EGL-4 molécula aqui descrita proporciona uma leitura robusto molecular de adaptação olfactiva em C. elegans. O odor induzidas ensaios de translocação nuclear são simples e requerem apenas alguns dias de tempo de preparação. O animal pyIs500 que construímos para estes ensaios, expressa um marcador, que ilumina o neurónio AWC, bem como a expressão da GFP-tagged proteína EGL-4. Assim, sentimos que um experimentador com pouca ou nenhuma experiên...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptona </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Fosfato de Potássio Dibásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Kimwipes - Pequeno </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> Escudo de ouro QuímicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odores diluição para os ensaios de quimiotaxia </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Sulfato de Magnésio </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Azida de sódio 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestésico </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose almofadas </td></tr><tr><td> Benzaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Butanona, ACS grau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Microtubos - 1,5 ml coloridas </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur 5-3/4 copo descartável &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integração UV </td></tr><tr><td> Garrafa de vácuo Filter - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Durante a estimulação sustentada neurónios sensoriais mais irá adaptar a sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda a atenção forma e também protege as células de mais de estimulação. Adaptação no circuito olfativo de C. elegans foi descrita pela primeira vez por Colbert e Bargmann 1,2. Aqui, os autores definiram parâmetros do paradigma adaptação olfativa, que eles usaram para projetar uma tela de genética para isolar mutantes defectivos na sua capacidade de adaptação a odores voláteis sentidas pelas células Asa Amphid tipo C (AWC) neurônios sensoriais. Quando wildtype C. elegans animais são expostos a um odor atraente sentiu-AWC 3 para 30 min irão adaptar a sua capacidade de resposta ao odor e ignorará o odor a adaptar de um ensaio de quimiotaxia de comportamento de ~ 1 hora. Quando wildtype C. elegans animais estão expostos a um odor AWC-sentia atraente para ~ 1 hora então eles vão ignorar o odor adaptação em achemotaxis ensaio comportamental para ~ 3 hr. Estas duas fases de adaptação olfativa em C. elegans foram descritos como de curto prazo de adaptação olfactiva (induzida após 30 min de exposição odor), e a longo prazo de adaptação olfactiva (induzida após 60 min de exposição odor). Mais tarde, o trabalho de L&#39;Etoile et al., 4 descoberto uma proteína quinase G (PKG) chamado EGL-4 que é necessário tanto para a adaptação a curto prazo e de longo prazo em neurônios olfativos AWC. A EGL-4 proteína contém uma sequência de localização nuclear que é necessário para respostas a longo prazo de adaptação olfativa, mas dispensáveis ​​para respostas de curto prazo de adaptação olfativa no 4 AWC. Ao marcar EGL-4 com uma proteína verde fluorescente, foi possível visualizar a localização da EGL-4 no AWC durante a exposição prolongada odor. Usando esta totalmente funcional GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula temos sido capazes de desenvolver um visor molecular de adaptação a longo prazo no olfactory 5 AWC. Usando este mleitura olecular de adaptação olfactiva temos sido capazes de realizar as duas telas para a frente e reverso genéticos para identificar os animais mutantes que exibem padrões defeituosos localização subcelular de GFP :: EGL-4 em 6,7 a AWC. Aqui descrevemos a: 1) a construção de GFP :: EGL-4 animais que expressam, 2) o protocolo para o cultivo de animais para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nuclear, e 3) a pontuação do odor a longo prazo induzida evento de translocação nuclear e recuperação (re-sensibilização) da GFP nuclear :: EGL-4 estado.

Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4in a CTA, antes e após exposição prolongada odor é mostrado na Figura 2. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da CTA (Figura 2B), e após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo da CTA (Figura 2D). No nível comportamental, os animais com citosólica GFP :: EGL-4 em AWC são atraídas para uma fonte pontual de odor (Figura 2C ...

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neurociência

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

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Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

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Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...