Name: a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans at JoVE.com

Vi vill tacka Scott Hamilton och medlemmar av O&#39;Halloran labb för noggrann läsning av detta manuskript. Vi tackar också våra anonyma granskare för utmärkta förslag och kommentarer insiktsfulla.

1. Konstruktion av GFP Tagged EGL-4 uttryckande djur <ol><li> Klona translationell fusion GFP :: EGL-4 under promotom för ODR-3-genen (användning 2678 bp direkt uppströms om startkodonet): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 promotorn driver uttryck i amphid neuron par: AWA, AWB, AWC och svagt ASH. </li><li> Injicera plasmiden (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 till vildtyp (N2) djur vid 50 ng / ul med co-injektion markörer med standard bakterie-line transformationstekniker 8: <e...

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1.">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575 (2000).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

Den lukt-inducerad kärnkraft inmatning av en GFP-märkt EGL-4-molekylen som beskrivs här ger en robust molekylär avläsning av luktsinnet anpassning C. elegans. De lukt-inducerade nukleär translokation analyser är enkla och kräver bara några dagars förberedelsetid. Den pyIs500 djur som vi har konstruerat för dessa analyser, uttrycker en markör som belyser AWC neuron samt uttrycker GFP-märkta EGL-4-proteinet. Därför anser vi att en försöksledaren med liten eller ingen erfarenhet av att ar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM plattor </td></tr><tr><td> NATRIUMKLORID </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> NGM plattor </td></tr><tr><td> Bacto pepton </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM plattor </td></tr><tr><td> Dibasiskt kaliumfosfat </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-Basal buffert och NGM plattor </td></tr><tr><td> Monobasiskt kaliumfosfat </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-Basal buffert och NGM plattor </td></tr><tr><td> Kimwipes - Små </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol 100% </td><td> Guld Shield KemiskCo </td><td> 43196-115 </td><td> utspädning lukter för kemotaxi analyser </td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM plattor </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150.136-500G </td><td> NGM plattor </td></tr><tr><td> Natriumazid 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Bedövningsmedel </td></tr><tr><td> Agaros - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agaros kuddar </td></tr><tr><td> Bensaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> AWC lukt </td></tr><tr><td> Butanon, ACS Grade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> AWC lukt </td></tr><tr><td> Mikrocentrifugrör - 1,5 ml Färgade </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteurpipett Disponibel Glas 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV-integration </td></tr><tr><td> Filter Ståltermos - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Under ihållande stimulering mest sensoriska neuroner kommer att anpassa sina svar genom att minska deras känslighet för signalen. Anpassningen svar hjälper form uppmärksamhet och även skyddar cellerna från över-stimulering. Anpassning inom lukt kretsen av C. elegans beskrevs först av Colbert och Bargmann 1,2. Här författarna definierade parametrarna för luktsinnet anpassningen paradigm, som de använde för att utforma en genetisk skärm för att isolera mutanter defekta i sin förmåga att anpassa sig till flyktiga lukt avkännas av Amphid Wing celler av typ C (AWC) sensoriska neuroner. När vildtyp C. elegans djur utsätts för en attraktiv AWC-kände lukt 3 för 30 minuter som de kommer att anpassa sin lyhördhet för lukt och kommer då att ignorera anpassa lukt i en kemotaxi beteende analys för ~ 1 timme. När vildtyp C. elegans djur utsätts för en attraktiv AWC-kände lukt för ~ 1 timme som de sedan kommer att ignorera anpassa lukt i AChemotaxis beteende analys för ~ 3 timmar. Dessa två faser lukt anpassning i C. elegans beskrevs som kortvarig lukt anpassning (induceras efter 30 min lukt exponering), och långsiktig lukt anpassning (induceras efter 60 min lukt exponering). Senare arbete från L&#39;Etoile et al. Avslöjat 4 en proteinkinas G (PKG) kallas EGL-4 som krävs för både kort och lång sikt lukt anpassning i AWC nervceller. Det EGL-4-protein innehåller en nukleär lokalisering sekvens som är nödvändig för långsiktiga lukt anpassningsåtgärder men umbärliga för kortfristiga lukt anpassningsåtgärder i AWC 4. Genom märkning EGL-4 med ett grönt fluorescerande protein, var det möjligt att visualisera lokaliseringen av EGL-4 i AWC under långvarig lukt exponering. Med hjälp av denna fullt fungerande GFP-märkta EGL-4 (GFP :: EGL-4)-molekylen har vi kunnat utveckla en molekylär avläsning av långvarig lukt anpassning i AWC 5. Med användning av denna molecular avläsning av luktsinnet anpassning har vi kunnat utföra både framåt och bakåt genetiska skärmar för att identifiera muterade djur som uppvisar defekta subcellulära lokalisering mönster av GFP :: EGL-4 i AWC 6,7. Här beskriver vi: 1) konstruktion av GFP :: EGL-4 uttryckande djur, 2) protokollet för odling av djur för långsiktiga lukt-inducerad nukleär translokation analyser, och 3) poäng i den långsiktiga lukt-inducerad nukleär translokation händelse och återhämtning (åter allergi) från den nukleära GFP :: EGL-4 tillstånd.

Ett exempel på lokalisering mönstret av GFP :: EGL-4I den AWC före och efter långvarig lukt exponering visas i figur 2. Före långvarig lukt exponering, GFP :: EGL-4 är lokaliserad till cytosolen av AWC (figur 2B), och efter 80 minuter lukt exponering GFP :: är EGL-4 lokaliserad till kärnan av AWC (figur 2D). På beteendemässiga nivå, djur med cytosoliskt GFP :: EGL-4 i AWC attraheras av en punktkälla av lukt (Figur 2C grafer representativa r...

Watch this Scientific Journal Video about A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans at JoVE.com

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Här beskriver vi en molekylär avläsning av långvarig lukt anpassning<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Den proteinkinas G, EGL-4, är nödvändig för stabila anpassningsåtgärder i den primära sensoriska neuron par kallas AWC. Under längre lukt exponering EGL-4 translokeras från cytosolen till kärnan i AWC.

En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

C. elegans Positiva Butanon lärande, kortsiktiga och långsiktiga Associativa analyser Minne

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatiserad Kvantifiering av synaptisk Fluorescens i<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Långsiktig Behavioral Spårning av fritt Simning Svagt Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Långsiktig Time Lapse avbildning av Mouse Cochlear Explantat

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers för Långsiktig Kalcium Imaging av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Automatiserad analys av<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Behavior Använda Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Quadruple Immunostaining av Olfactory Bulb för Visualisering av Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Använda en anpassad mikroflödessystem Olfactory Chip för bildtagning av Neuronal aktivitet som svar på feromoner i manlig C. Elegans huvud nervceller

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...