Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door fondsen die door de Universiteit van North Carolina in Charlotte, Wachovia stichting fonds voor faculteit excellentie, en een subsidie ​​van NIGMS (R15GM101571).

1. LSE Voorbereiding <ol><li> Vrouw kikkers (Xenopus laevis) worden twee keer geïnjecteerd voor eieren ophalen. De eerste injectie (priming) is 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) per kikker. Kikkers moet worden voorbehandeld ten minste twee dagen voor de inducerende leggen van eieren en gegrond kikkers zijn bruikbaar voor maximaal twee weken. Om prime kikkers, injecteren PMSG subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 3 ml spuit en 27 G-naald. </li><li> Om eieren leggen te induceren, ...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Er zijn verschillende voordelen bij het ​​bestuderen van DNA schade checkpoint met Xenopus ei extracten. Het gebruik van ei extracten biedt een grote hoeveelheid celvrije extracten gesynchroniseerd interfase van de celcyclus. Het ei extracten gemakkelijk en goedkoop worden gemaakt. Het is relatief eenvoudig aan DNA of chromatine beschadigen en een defect in de DNA schade checkpoint blijkt na immunodepleting een doeleiwit uit ei extract. Vervolgens kan een potentiaalfunctie defect worden &quot;gered&quot; do...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 antilichaam </td><td> Cell Signaling </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-antilichaam Chk1 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinine </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-Cysteine </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Methylmethaansulfonaat (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monsterbuffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12.041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Emmer voor het leggen van eieren </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC centrifuge met swingende emmer rotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 swingende emmer rotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 plus SuperSpeed ​​centrifuge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UV-crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oplossingen </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, breng de pH op 7,8 met 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinine / Leupeptine voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml elk in water. Geheugen 20 pi aliquots bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH aangepast tot 7,5 door HCl </td></tr><tr><td> Cycloheximide voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in water. Store 1 ml porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasine B voorraad </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Geheugen 20 pi aliquots bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) voorraad </td><td></td><td></td><td> 1 M in water. Store 1 ml porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 ug / ml cycloheximide, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. 5 pi aliquots slaan bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energie Mengsel </td><td></td><td></td><td> 375 mM creatinefosfaat, 50 mM ATP, en 25 mM MgCl2. Aliquots worden opgeslagen bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Nuclear kleurstofoplossing </td><td></td><td></td><td> 0,4 ug / ml Hoechst 33258, 25% glycerol(V / v), in 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin voorraad </td><td></td><td></td><td> 100 uM in DMSO. Opslaan 10 pi aliquots bij -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Op een dagelijkse basis, worden cellen blootgesteld aan verschillende endogene en milieubeschadigingen. Om deze beledigingen bestrijden zijn cellen ontwikkeld DNA schade checkpoint signalering als een controlemechanisme om DNA schade en direct cellulaire responsen waarnemen op DNA schade. Er zijn verschillende groepen van eiwitten genaamd sensoren, transducers en effectors betrokken bij DNA schade checkpoint signalering (figuur 1). In dit complex signaalweg ATR (ATM en Rad3 gerelateerde) is een van de belangrijkste kinases die reageren op DNA schade en replicatie stress. Geactiveerde ATR kan fosforyleren haar downstream substraten zoals Chk1 (Checkpoint kinase 1). Bijgevolg gefosforyleerd en geactiveerd Chk1 leidt tot veel stroomafwaarts gelegen in de DNA schade checkpoint waaronder celcyclus, transcriptie activatie DNA schade herstel en apoptose of senescentie (figuur 1). Als DNA beschadigd is, niet aan de DNA-schade checkpoint resultaten te activeren in unrepuitgezonden schade en vervolgens genomische instabiliteit. De studie van de DNA schade checkpoint verduidelijken hoe cellen genomische integriteit en een beter begrip van menselijke ziekten, zoals kanker, te ontwikkelen. Xenopus laevis ei extracten ontstaan ​​als krachtig celvrij extract modelsysteem DNA schade checkpoint onderzoek. Lage snelheid extract (LSE) werd aanvankelijk beschreven door de Masui groep 1. De toevoeging van demembranated sperma chromatine te LSE resulteert in vorming kernen waar DNA wordt gerepliceerd in een semiconservatieve wijze eenmaal per celcyclus. De ATR/Chk1-mediated checkpoint signaleringsroute wordt geactiveerd door DNA-schade of replicatie spanning 2. Twee methoden worden momenteel gebruikt om de DNA schade veroorzaken checkpoint: DNA beschadigende benaderingen en DNA schade gelijkende structuren 3. DNA schade kan worden veroorzaakt door ultraviolet (UV) bestraling, γ-straling, methyl methaanesulfonate (MMS), mitomycine C (MMC), 4-nitrochinoline-1-oxide (4-NQO) of aphidicoline 3, 4. MMS is een alkylerende stof die DNA-replicatie remt en activeert de ATR/Chk1-mediated DNA-schade checkpoint 4-7. UV bestraling activeert ook ATR/Chk1-dependent DNA schade checkpoint 8. De DNA schade gelijkende structuur AT70 is gegloeide complex van twee oligonucleotiden poly-(dA) 70 en poly-(dT) 70. De AT70-systeem is ontwikkeld in het laboratorium van Bill Dunphy&#39;s en wordt veel gebruikt om negen-twaalf veroorzaken ATR/Chk1 checkpoint signalering. We beschrijven protocollen (1) celvrije extracten ei (LSE) te bereiden, (2) Xenopus sperma chromatine behandelen met twee verschillende DNA beschadigen benaderingen (MMS en UV), (3) de DNA schade gelijkende structuur bereiden AT70, en (4) de ATR/Chk1-mediated DNA schade veroorzaken ijkpunt in LSE met beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus ei extract is een nuttig modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol is voor de bereiding van Xenopus ei extracten en DNA schade checkpoint inducerende reagentia. Deze technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van DNA beschadigende benaderingen in de studie van de DNA schade checkpoint signaling.

Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extracten

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Door de computer gegenereerde Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Voorbereiding en Fractionering van Xenopus laevis Egg Extracten

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Productie van<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extracten aan microtubuli-geassocieerde RNA&#39;s identificeren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle<em&gt; In Situ</em&gt; Met behulp van de TUNEL Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...