Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
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Ce travail est soutenu en partie par des fonds fournis par l&#39;Université de Caroline du Nord à Charlotte, Wachovia Fondation Caisse d&#39;excellence faculté, et une subvention de NIGMS (R15GM101571).

1. Préparation LSE <ol><li> Grenouilles femelles (Xenopus laevis) sont injectées deux fois pour la collecte des œufs. La première injection (amorçage) est de 100 U PMSG (gonadotrophine sérique de jument gravide) par grenouille. Grenouilles doit être amorcée au moins deux jours avant d&#39;œuf induisant la ponte et les grenouilles apprêtées sont utilisables jusqu&#39;à deux semaines. Pour les grenouilles premiers, injecter PMSG voie sous-cutanée dans les sacs lymphatiques dorsaux en utilisant une ...

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Il ya plusieurs avantages à étudier le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN en utilisant Xenopus extraits d&#39;œufs. L&#39;utilisation d&#39;extraits d&#39;oeufs fournit une grande quantité d&#39;extraits exempts de cellules synchronisées en interphase du cycle cellulaire. Les extraits d&#39;oeufs peuvent être facilement et économiquement faite. Il est relativement facile à endommager l&#39;ADN ou de la chromatine et de révéler un défaut dans le poste de contrôle de dommages de l&#39;ADN apr...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 anticorps </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Chk1 anticorps anti- </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;aprotinine </td><td> MP Biomédical </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Méthyl méthanesulfonate (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;échantillon </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycine </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Seau pour la ponte </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 CEI centrifugeuse avec rotor à godets oscillants </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotor à godets oscillants </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6, plus centrifugeuse superspeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Réticulation UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM de KCl, 0,5 mM MgSO4, CaCl2 2,5 mM, HEPES 5 mM, ajuster le pH à 7,8 avec NaOH 10 M </td></tr><tr><td> L&#39;aprotinine / Leupeptine actions </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans de l&#39;eau. Stocker 20 aliquotes à -80 ° C. </td></tr><tr><td> X tampon </td><td></td><td></td><td> 0,2 M de saccharose, 80 mM de KCl, 15 mM de NaCl, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM, ajuster le pH à 7,5 par HCl </td></tr><tr><td> Actions cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans de l&#39;eau. Boutique aliquotes de 1 ml à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasine B de stock </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml dans du DMSO. Stocker 20 aliquotes à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) de bouillon </td><td></td><td></td><td> 1 M dans l&#39;eau. Boutique aliquotes de 1 ml à -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M de saccharose, 1 mM DTT, 50 pg / ml de cycloheximide, MgCl2 2,5 mM, KCl 50 mM, HEPES 10 mM, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole actions </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans du DMSO. Stocker 5 aliquotes à -80 ° C. </td></tr><tr><td> Mélange d&#39;énergie </td><td></td><td></td><td> 375 mM de phosphate de créatine, ATP 50 mM et 25 mM MgCl 2. Des aliquotes sont enregistrés à -80 ° C. </td></tr><tr><td> Solution de colorant nucléaire </td><td></td><td></td><td> 0,4 pg / ml de Hoechst 33258, le glycérol 25%(V / v), dans du PBS 1x </td></tr><tr><td> Actions tautomycine </td><td></td><td></td><td> 100 M dans le DMSO. Stocker 10 aliquotes à -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Sur une base quotidienne, les cellules sont soumises à une variété d&#39;insultes endogènes et environnementaux. Pour lutter contre ces insultes, les cellules ont évolué checkpoint dommages à l&#39;ADN de signalisation comme un mécanisme de surveillance afin de détecter les dommages de l&#39;ADN et directs réponses cellulaires aux dommages à l&#39;ADN. Il ya plusieurs groupes de protéines appelés capteurs, transducteurs et des effecteurs impliqués dans la signalisation checkpoint dommages de l&#39;ADN (figure 1). Dans cette voie de signalisation complexe, ATR (ATM et Rad3 liée) est l&#39;un des principaux kinases qui peuvent répondre aux dommages à l&#39;ADN et le stress de réplication. Activé ATR peut phosphoryler ses substrats en aval tels que Chk1 (Checkpoint kinase 1). Par conséquent, phosphorylée et activée Chk1 conduit à de nombreux effets en aval sur le check-point dommages à l&#39;ADN, y compris l&#39;arrêt du cycle cellulaire, activation de la transcription, réparation de l&#39;ADN et l&#39;apoptose ou la sénescence (Figure 1). Lorsque l&#39;ADN est endommagé, ne pas activer les dommages à l&#39;ADN des résultats de points de contrôle dans unrepdommages aéré et, par la suite, l&#39;instabilité génomique. L&#39;étude du point de contrôle dommages à l&#39;ADN permettront d&#39;élucider comment les cellules de maintenir l&#39;intégrité du génome et de fournir une meilleure compréhension de la façon dont les maladies humaines telles que le cancer, se développer. Xenopus laevis extraits d&#39;œufs sont en train de devenir un puissant système acellulaire modèle extrait dans la recherche checkpoint dommages de l&#39;ADN. À basse vitesse extrait (LSE) a été initialement décrite par le groupe Masui 1. L&#39;ajout de la chromatine des spermatozoïdes demembranated aux résultats LSE dans la formation des noyaux où l&#39;ADN est répliqué de façon semiconservative une fois par cycle cellulaire. La voie de signalisation ATR/Chk1-mediated point de contrôle est déclenché par lésions de l&#39;ADN ou 2 stress réplicatif. Deux méthodes sont actuellement utilisées pour induire le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN: approches endommageant l&#39;ADN et l&#39;ADN des dommages imitant les structures 3. Altération de l&#39;ADN peut être induite par les rayons ultraviolets (UV), γ-irradiation, méthyle méthaneesulfonate (MMS), la mitomycine C (MMC), 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4-NQO), ou aphidicoline 3, 4. MMS est un agent alkylant qui inhibe la réplication de l&#39;ADN et active le point de contrôle des dommages l&#39;ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiation UV déclenche également la 8 ADN ATR/Chk1-dependent dommages checkpoint. L&#39;ADN des dommages-imitant la structure AT70 est un complexe recuit de deux oligonucléotides poly-(dA) 70 et le poly-(dT) 70. Le système AT70 a été développé dans le laboratoire Bill Dunphy et est largement utilisé pour induire ATR/Chk1 signalisation aux points de contrôle 9-12. Ici, nous décrivons les protocoles (1) pour préparer des extraits d&#39;œufs exempts de cellules (LSE), (2) pour traiter la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus avec deux ADN différents endommager les approches (MMS et UV), (3) pour préparer l&#39;ADN des dommages imitant la structure AT70, et (4) pour déclencher le point de contrôle des dommages dans l&#39;ADN ATR/Chk1-mediated LSE avec la chromatine de sperme endommagé ou un dommage d&#39;ADN-imitant la structure.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d&#39;extraits d&#39;œufs de xénope et de l&#39;ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d&#39;approches endommageant l&#39;ADN dans l&#39;étude de la signalisation checkpoint dommages de l&#39;ADN.

Etude de l&#39;ADN à l&#39;aide de Checkpoint dommages<em&gt; Xenopus</emExtraits d&#39;oeufs&gt;

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