Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
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Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel von der University of North Carolina in Charlotte, Wachovia Stiftungsfonds für Dozenten excellence, und einem Zuschuss von NIGMS (R15GM101571) vorgesehen ist.

Ein. LSE Vorbereitung <ol><li> Female Fröschen (Xenopus laevis) zweimal für Eiersammlung injiziert. Die erste Injektion (Grundierung) 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) pro Frosch. Frösche muss grundiert mindestens zwei Tage vor induzierende Eiablage und grundiert Frösche sind geeignet für bis zu zwei Wochen. Um prime Frösche, injizieren PMSG subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einem 3 ml-Spritze und 27 G Nadel. </li><li> Um Eiablage zu induzieren, zu injizieren 500 U hCG (humanes Chorion...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Es gibt mehrere Vorteile bei der Untersuchung der DNA-Schädigung unter Verwendung Prüfpunkt Xenopus Ei-Extrakten. Die Verwendung von Ei-Extrakten stellt eine große Menge von zellfreien Extrakten in Interphase des Zellzyklus synchronisiert. Die Ei-Extrakten kann leicht und kostengünstig hergestellt werden. Es ist relativ leicht zu DNA oder Chromatin beschädigen und einen Defekt in der DNA-Schädigung Checkpoint nach immunodepleting eines Zielproteins aus Eiextrakt offenbaren. Anschließend kann eine potenti...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 Antikörper </td><td> Cell Signaling </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Chk1 Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Methylmethansulfonat (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129.925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Probenpuffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Eimer für die Eiablage </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC Zentrifuge mit Ausschwingrotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 Ausschwingrotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 Plus Superspeed-Zentrifuge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH auf 7,8 mit 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / Leupeptin Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in Wasser. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M Sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH auf 7,5 mit HCl </td></tr><tr><td> Cycloheximid Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B Lager </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) stock </td><td></td><td></td><td> 1 M in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M Saccharose, 1 mM DTT, 50 ug / ml Cycloheximid, 2,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazol Lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. Bewahren 5 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energie Mixture </td><td></td><td></td><td> 375 mM Creatinphosphat, 50 mM ATP und 25 mM MgCl 2. Aliquots werden bei -80 ° C gespeicherten </td></tr><tr><td> Nuclear Farbstofflösung </td><td></td><td></td><td> 0,4 ug / ml Hoechst 33258, 25% Glycerin(V / v), in 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin Lager </td><td></td><td></td><td> 100 uM in DMSO. Bewahren Sie 10 ul Aliquots bei -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Auf einer täglichen Basis, werden die Zellen zu einer Vielzahl von endogenen und Umwelteinflüssen ausgesetzt. Um diese Beleidigungen zu bekämpfen, haben Zellen DNA damage checkpoint Signalisierung als Überwachungs-Mechanismus, um DNA-Schäden und direkte zelluläre Antworten auf DNA-Schäden spüren entwickelt. Es gibt mehrere Gruppen von Proteinen namens Sensoren, Wandlern und Effektoren in DNA damage checkpoint-Signalisierung (Abbildung 1) beteiligt. In diesem komplexen Signalwegs ist ATR (ATM und Rad3-bezogen) einer der wichtigsten Kinasen, die zu DNA-Schädigungen und Replikation Streß reagieren. Activated ATR kann phosphorylieren seine nachgelagerten Substrate wie Chk1 (Checkpoint Kinase 1). Folglich phosphoryliert und aktiviert Chk1 führt zu viele stromabwärts Wirkungen in der DNA-Schädigung Prüfpunkt einschließlich Zellzyklusarrest, Transkriptionsaktivierung, DNA-Schäden zu reparieren und Apoptose oder Seneszenz (Abbildung 1). Wenn DNA beschädigt ist, es nicht die DNA damage checkpoint Ergebnisse in UNREP aktivierenausgestrahlt Schäden und anschließend genomische Instabilität. Die Untersuchung der DNA damage checkpoint wird klären, wie Zellen genomischen Integrität zu erhalten und ein besseres Verständnis davon, wie Krankheiten, wie Krebs, zu entwickeln. Xenopus laevis Ei Extrakte werden als starke zellfreien Extrakt Modellsystem in DNA-Schädigung Prüfpunkt Forschung entstehen. Low-Speed-Extrakt (LSE) wurde ursprünglich von der Masui Gruppe 1 beschrieben. Die Zugabe von demembranated Spermienchromatin LSE Ergebnisse in Keimbildung, wo DNA in einem semikonservativen fashion einmal pro Zellzyklus repliziert wird. Die ATR/Chk1-mediated Checkpoint-Signalweg ist durch DNA-Schädigung oder Replikation Stress 2 ausgelöst. Zwei Methoden werden derzeit verwendet, um die DNA damage checkpoint induzieren: DNA-schädigende Ansätze und DNA-Schäden-ähnlichen Strukturen 3. DNA-Schädigung durch Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, γ-Bestrahlung, induziert werden Methyl methanesulfonate (MMS), Mitomycin C (MMC), 4-nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) oder Aphidicolin 3, 4. MMS ist ein Alkylierungsmittel, das DNA-Replikation hemmt und aktiviert der DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt 4-7. UV-Bestrahlung löst auch die ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. Die DNA-Schädigung nachahmende Struktur AT70 ist ein Komplex aus zwei getemperten Oligonukleotide Poly-(dA) 70 und Poly-(dT) 70. Die AT70 System wurde Bill Dunphy Labor entwickelt und wird häufig verwendet, um ATR/Chk1 Checkpoint Signalisierung 9-12 induzieren. Hier beschreiben wir Protokollen (1) bis zellfreie Extrakte Ei (LSE) herzustellen, (2) an Xenopus Spermienchromatinstruktur mit zwei verschiedenen DNA schädigen Ansätze (MMS und UV), (3) zu behandeln, um die DNA-Schäden-nachahmende Struktur vorzubereiten AT70, und (4) die DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt in LSE mit beschädigten Spermienchromatinstruktur oder einem DNA-Schaden-nachahmende Struktur auslösen.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

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Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

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Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

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Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...