Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).

1. הכנת LSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפרדעי נשים (Xenopus laevis) מוזרקות פעמים לאיסוף ביצים. הזריקה הראשונה (יחול) היא 100 U PMSG (Mare הסרום גונדוטרופין הריון) לצפרדע. צפרדעים חייבות להיות דרוכות לפחות ימים לפני ביצת גרימת הנחת וצפרדעים דרוכות הן שמישו?...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ&quot;א לא?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 נוגדן </td><td> איתות תא </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Chk1 </td><td> סנט קרוז </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> סיגמא </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352-1 ק&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> מתיל methanesulfonate (MMS) </td><td> סיגמא </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> סיגמא </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ מדגם </td><td> סיגמא </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako כימיקלי ארה&quot;ב </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> דלי להטלת ביצים </td><td> מוצרי Rubbermaid המסחריים </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה CL2 IEC עם הרוטור דלי מתנדנד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> הרוטור דלי HB6 נדנוד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> crosslinker UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 המ&quot;מימ NaCl, 2 המ&quot;מ KCl, 0.5 mM 4 MgSO, 2.5 המ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.8 עם 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / מניות Leupeptin </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד במים. אחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> X החיץ </td><td></td><td></td><td> סוכרוז 0.2 מ &#39;, 80 המ&quot;מ KCl, 15 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.5 ידי HCl </td></tr><tr><td> מניית Cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B המניות </td><td></td><td></td><td> 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 20 aliquots μl ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> מניית Dithiothreitol (DTT) </td><td></td><td></td><td> M 1 במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 סוכרוז M, 1 mM DTT, 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל cycloheximide, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 50 mM KCl, 10 HEPES מ&quot;מ, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole המניות </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 5 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> תערובת אנרגיה </td><td></td><td></td><td> פוספט 375 מ&quot;מ קריאטין, 50 mM ATP, ו25 מ&quot;מ MgCl 2. Aliquots נשמרים ב-80 ° C. </td></tr><tr><td> פתרון לצבוע גרעיני </td><td></td><td></td><td> 0.4 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33258, גליצרול 25%(V / v), ב1x PBS </td></tr><tr><td> מניית Tautomycin </td><td></td><td></td><td> 100 מיקרומטר בDMSO. אחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ&quot;א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ&quot;א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ&quot;א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ&quot;א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ&quot;א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ&quot;א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ&quot;א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ&quot;א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ&quot;א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח. תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ&quot;א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא. מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ&quot;א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ&quot;א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ&quot;א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ&quot;א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ&quot;א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...