Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
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この作品は、ノースカロライナ大学シャーロット校、教員の卓越性のためのワコビア基礎基金、NIGMS（R15GM101571）からの助成金によって提供された資金によって部分的にサポートされています。

1。 LSEの準備<ol><li>雌のカエル（ アフリカツメガエル ） は採卵のために二度注射する。最初の注入（プライミング）は、カエルあたり100 U PMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）です。カエルは、少なくとも2日間卵を敷設し、下塗りしたカエルを誘導する前に下塗りしなければならない最大2週間のために使用可能である。素数カエルに、3 mlのシリンジと27Gの針を用いて背部リ?...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

アフリカツメガエルの卵抽出液を用いたDNA損傷チェックポイントを研究する際にはいくつかの利点があります。卵抽出物の使用は、細胞周期の間期で同期無細胞抽出液を大量に提供しています。卵抽出物を容易かつ安価に行うことができます。これは、DNAやクロマチンを損傷すると卵抽出液から目的タンパク質をimmunodepleting後のDNA損傷チェックポイントの欠陥を明らかにすることは比...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>アンチChk1のP-S344抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td>抗Chk1の抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ</td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシンB </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCGの</td><td>シグマ</td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-システイン</td><td>シグマ</td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td>メタンスルホン酸メチル（MMS） </td><td>シグマ</td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>シグマ</td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td>カルビオケム</td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td>サンプルバッファー</td><td>シグマ</td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td>和光ケミカルUSA </td><td> 209から12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>産卵用のバケツ</td><td>ラバーメイドコマーシャル製品</td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td>スウィングローターとCL2のIEC遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6スイングバケットローター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td>ソーバルRC6プラス超高速遠心機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UVクロスリンカー</td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ソリューション </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100mMのNaCl、2 mMの塩化カリウム、0.5mMのMgSO 4を 、2.5 mMのCaCl 2、5mMのHEPESは、10M NaOHで7.8にpHを調整</td></tr><tr><td>アプロチニン/ロイペプチン株式</td><td></td><td></td><td>水に10 mg / mlの各。 -80℃で、20μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>バッファX </td><td></td><td></td><td> 0.2 Mスクロース、80mMのKClを、15mMのNaCl、5mMのMgCl 2、1mMのEDTA、10mMのHEPESは、HClでpHを7.5に調整</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド株式</td><td></td><td></td><td> 1水中で0 mg / mlである。 -20℃で保存して1mlのアリコート</td></tr><tr><td>サイトカラシンB株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中5 mg / mlである。 -20℃で、20μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT）の株式</td><td></td><td></td><td>水の中の1 M。 -20℃で保存して1mlのアリコート</td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25Mスクロース、1mMのDTT、50μg/ mlのシクロヘキシミド、2.5mMのMgCl 2、50mMのKCl、10mMのHEPES、pH7.7 </td></tr><tr><td>ノコダゾール株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中10 mg / mlである。 -80℃で5μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>エネルギー混合</td><td></td><td></td><td> 375 mMのクレアチンリン酸、50mMのATP、および25 mMのMgCl 2。アリコートを-80℃で保存されます</td></tr><tr><td>核色素溶液</td><td></td><td></td><td> 0.4μg/ mlのヘキスト33258、25％グリセロール（v / v）を、1×PBS中</td></tr><tr><td> Tautomycin株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中の100μM。 -80℃で10μlアリコートを保存</td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

毎日のように、細胞は内因性と環境の様々な侮辱にさらされる。これらの侮辱に対抗するために、細胞はDNA損傷に対するDNA損傷と直接的な細胞応答を検知する監視機構としてシグナリングDNA損傷チェックポイントを進化させてきた。 DNA損傷チェックポイントシグナル（ 図1）に関わるセンサ、トランスデューサとエフェクターと呼ばれるタンパク質のいくつかのグループがあります。この複雑なシグナル伝達経路では、ATR（ATMとRAD3関連）がDNA損傷と複製ストレスに応答することができる主要なキナーゼの一つである。活性化されたATRは、そのようなのChk1（チェックポイントキナーゼ1）のような、その下流の基質をリン酸化することができます。その結果、リン酸化され、活性化されChk1は、細胞周期の停止、転写活性化、DNA損傷修復、アポトーシスや老化（ 図1）を含むDNA損傷チェックポイントには多くの下 ​​流効果につながる。 DNAが損傷されると、unrepでDNA損傷チェックポイントの結果を有効にするには失敗放映された被害と、その後、ゲノム不安定性。 DNA損傷チェックポイントの研究では、細胞は、ゲノムの完全性を維持する方法を解明し、癌などの方法ヒト疾患のより良い理解を提供し、開発していきます。 アフリカツメガエル卵抽出液は、DNA損傷チェックポイントの研究に強力な無細胞抽出液をモデル系として浮上している。低速抽出（LSE）は、当初、増井グループ1によって記述されていた。 DNAは細胞周期ごとに必ず一度、半保存方法で複製されている核形成のLSEの結果にdemembranated精子クロマチンの追加。 ATR/Chk1-mediatedチェックポイントシグナル伝達経路はDNA損傷や複製ストレス2によってトリガされます。 DNA損傷のアプローチとDNA損傷を模倣構造3：2つの方法は、現在、DNA損傷チェックポイントを誘導するために使用されています。 DNA損傷は、紫外線（UV）照射、γ線照射、メチルメタンによって誘導することができるesulfonate（MMS）、マイトマイシンC（MMC）、4 -ニトロキノリン-1 -オキシド（4-NQO）、またはアフィジコリン3、4。 MMSはDNA複製を阻害し、ATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントの活性化4-7アルキル化剤である。 UV照射もATR/Chk1-dependent DNA損傷チェックポイント8をトリガします 。 DNA損傷模倣構造AT70は、2つのオリゴヌクレオチド、ポリ - （DA）70とポリ（dT）を70のアニールされた複合体である。 AT70システムはビルダンフィーの研究室で開発したと9月12日 、広くATR/Chk1チェックポイントシグナル伝達を誘導するために使用されています。 ここでは、（2）DNA損傷模倣構造を準備するために2つの異なるDNA損傷のアプローチ（MMSとUV）、（3）でアフリカツメガエルの精子クロマチンを治療するために、無細胞卵抽出（LSE）を準備するためのプロトコルは、（1）について説明AT70、（4）損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造を持つLSEでATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガします。

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...