Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
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Este trabalho é apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Carolina do Norte em Charlotte, fundo Wachovia base para a excelência do corpo docente, e uma bolsa de NIGMS (R15GM101571).

1. Preparação LSE <ol><li> Rãs do sexo feminino (Xenopus laevis) são injetadas duas vezes para coleta de ovos. A primeira injecção (ferragem) é de 100 U PMSG (gonadotrofina de égua prenhe) por sapo. Rãs deve ser preparada pelo menos dois dias antes de ovo indução assentamento e rãs condicionadas são utilizáveis ​​por até duas semanas. Para rãs primos, injetar por via subcutânea PMSG nos sacos linfáticos dorsal usando uma seringa de 3 ml e 27 agulha G. </li><li> Para induzir a postura de ...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Existem várias vantagens em estudar o posto danos no DNA utilizando extratos de Xenopus ovo. A utilização de extractos de ovo fornece uma grande quantidade de extractos livres de células sincronizadas em interfase do ciclo celular. Os extractos de ovos pode ser feita fácil e barata. É relativamente fácil para danificar o DNA ou cromatina e revelar um defeito no ponto de verificação, após danos no ADN immunodepleting uma proteína alvo a partir de extracto de ovo. Subsequentemente, um defeito da funç?...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-P-Chk1 S344 </td><td> Sinalização celular </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-Chk1 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-Cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metanossulfonato de metilo (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129.925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2mg </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de amostra </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals EUA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Balde para a postura de ovos </td><td> Produtos Rubbermaid comerciais </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 centrífuga IEC com rotor basculante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotor de caçamba móvel </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 mais centrífuga superspeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulador UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluções </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 0,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl 2, 5 mM de HEPES, pH ajustado a 7,8 com NaOH 10 M </td></tr><tr><td> Aprotinina / estoque Leupeptin </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml de cada uma em água. Armazenar 20 ul de aliquotas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Tampão X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M de sacarose, 80 mM de KCl, 15 mM NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 10 mM de HEPES, pH ajustado a 7,5 por HCl </td></tr><tr><td> Estoque cicloheximida </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml em água. Loja de aliquotas de 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Citocalasina B estoque </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml em DMSO. Armazenar 20 ul de aliquotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitol estoque (TDT) </td><td></td><td></td><td> 1 M em água. Loja de aliquotas de 1 ml a -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> Sacarose 0,25 M, 1 mM de DTT, 50 ug / ml de cicloheximida, 2,5 mM MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazol estoque </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml em DMSO. Armazenar aliquotas de 5 uL a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Mistura de energia </td><td></td><td></td><td> 375 mM de fosfato de creatina, ATP 50 mM e 25 mM de MgCl 2. Alíquotas são guardadas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Solução de corante nuclear </td><td></td><td></td><td> 0,4 ug / ml de Hoechst 33258 de glicerol, 25%(V / v), em PBS 1x </td></tr><tr><td> Estoque Tautomycin </td><td></td><td></td><td> 100 uM em DMSO. Armazenar aliquotas de 10 uL a -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Numa base diária, as células são sujeitas a uma variedade de insultos endógenos e ambientais. Para combater esses insultos, as células desenvolveram posto de controle de danos ao DNA sinalização como um mecanismo de vigilância para detectar danos no DNA e diretos respostas celulares a danos no DNA. Há diversos grupos de proteínas chamados sensores, transdutores e efetores envolvidos na sinalização de DNA checkpoint de dano (Figura 1). Neste caminho complexo de sinalização, ATR (ATM e Rad3-relacionados) é uma das quinases importantes que podem responder a danos no ADN e stress replicação. Activated ATR pode fosforilar os seus substratos a jusante, tais como o Chk1 (Ponto de verificação quinase 1). Consequentemente, fosforiladas e activadas Chk1 conduz a muitos efeitos a jusante do ponto de verificação, incluindo danos no DNA paragem do ciclo celular, a activação da transcrição, reparação de danos do ADN, e a apoptose ou senescência (Figura 1). Quando o DNA é danificado, não para ativar o DNA resultados checkpoint danos em unrepdanos ao ar e, posteriormente, instabilidade genômica. O estudo dos danos de ADN do ponto de verificação será elucidar como as células a manter a integridade do genoma e proporcionar um melhor entendimento de como as doenças humanas, tais como o cancro, se desenvolver. Extratos de ovos de Xenopus laevis estão surgindo como um poderoso modelo de sistema livre de células extrato no DNA pesquisa checkpoint danos. De baixa velocidade de extracto (LSE) foi inicialmente descrita por grupo Masui 1. A adição de cromatina espermática demembranated para os resultados na formação de núcleos de LSE, onde o DNA é replicado em uma forma semiconservativa uma vez por ciclo celular. A via de sinalização ATR/Chk1-mediated checkpoint é acionado por dano de DNA ou estresse replicação 2. Dois métodos são usados ​​atualmente para induzir o posto danos ao DNA: abordagens de DNA e DNA danos prejudiciais imitando-estruturas 3. Dano do ADN pode ser induzida por irradiação com ultravioleta (UV), γ-irradiação, metil metanesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido de (4-NQO), ou afidicolina 3, 4. O MMS é um agente alquilante que inibe a replicação do DNA e ativa o ponto de verificação danos ATR/Chk1-mediated DNA 4-7. Irradiação UV também provoca a ATR/Chk1-dependent DNA 8 checkpoint danos. A estrutura de ADN que imita dano-AT70 é um complexo de recozido de dois oligonucleótidos de poli-(dA) 70 e poli-(dT) 70. O sistema AT70 foi desenvolvido no laboratório Bill Dunphy e é amplamente utilizada para induzir a sinalização de checkpoint ATR/Chk1 9-12. Aqui, nós descrevemos protocolos (1) para preparar extractos isentos de células de ovos (LSE), (2) para o tratamento de Xenopus com cromatina de esperma dois ADN diferentes abordagens danificar (MMS e UV), (3) para preparar o DNA de danos estrutura imita AT70, e (4) para accionar o ponto de verificação ATR/Chk1-mediated danos no DNA LSE com cromatina espermática danificado ou uma estrutura de ADN que imita danos.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts (Video) | JoVE

Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis ​​a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

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