Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Este trabajo está apoyado en parte por fondos proporcionados por la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte, Wachovia fondo base para la excelencia docente, y una subvención de NIGMS (R15GM101571).

1. Preparación LSE <ol><li> Ranas hembra (Xenopus laevis) se inyecta dos veces para la recolección de huevos. La primera inyección (cebado) es 100 U PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) por rana. Las ranas se debe purgar por lo menos dos días antes de la inducción de huevo y por el que se ranas cebados son utilizables para un máximo de dos semanas. Para las ranas primos, inyectar PMSG por vía subcutánea en los sacos linfáticos dorsales usando una jeringa de 3 ml y aguja 27 G. </li><li> Para...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Hay varias ventajas en el estudio del punto de control de daño en el DNA utilizando extractos de Xenopus huevo. El uso de extractos de huevo proporciona una gran cantidad de extractos libres de células sincronizadas en la interfase del ciclo celular. Los extractos de huevo puede ser realizado fácilmente y económicamente. Es relativamente fácil de dañar el ADN o cromatina y para revelar un defecto en el punto de control de daño de ADN después de immunodepleting una proteína diana a partir de extracto de...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 anticuerpos </td><td> Señalización Celular </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Chk1 anticuerpos anti- </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> La aprotinina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> La cicloheximida </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metanosulfonato de metilo (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Muestra de tampón </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals EE.UU. </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Cuchara para la puesta de huevos </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC centrífuga con rotor basculante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotor basculante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 más centrifugadora supervelocidad </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulador UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluciones </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM de HEPES, ajustar el pH a 7,8 con 10 M NaOH </td></tr><tr><td> La aprotinina / Leupeptina acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml cada una en agua. Almacenar 20 alícuotas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M de sacarosa, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, ajustar el pH a 7,5 con HCl </td></tr><tr><td> La cicloheximida acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Citocalasina B de stock </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml en DMSO. Almacenar 20 alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) acciones </td><td></td><td></td><td> 1 M en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M sacarosa, 1 mM DTT, 50 ug / ml de cicloheximida, 2,5 mM de MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7 </td></tr><tr><td> Nocodazol acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml en DMSO. Guarde 5 alícuotas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Mezcla de Energía </td><td></td><td></td><td> 375 mM de fosfato de creatina, 50 mM de ATP, y 25 mM de MgCl 2. Las alícuotas se guardan a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Solución de tinte nuclear </td><td></td><td></td><td> 0,4 g / ml Hoechst 33258, glicerol 25%(V / v), en 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin acciones </td><td></td><td></td><td> 100 mM en DMSO. Almacenar 10 alícuotas a -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Sobre una base diaria, las células se someten a una variedad de lesiones endógenas y ambientales. Para combatir estas agresiones, las células han evolucionado checkpoint daño en el DNA de señalización como un mecanismo de vigilancia para detectar daños en el ADN y dirigir la respuesta celular al daño del ADN. Hay varios grupos de proteínas llamadas sensores, transductores y efectores implicados en la señalización de punto de control de daños en el ADN (Figura 1). En esta vía de señalización complejo, ATR (ATM y Rad3 relacionada-) es una de las principales quinasas que pueden responder al daño del ADN y la replicación del estrés. ATR activados pueden fosforilar sus sustratos tales como aguas abajo (quinasa Chk1 Checkpoint 1). En consecuencia, fosforila y activa Chk1 conduce a muchos efectos aguas abajo en el punto de control de daño del ADN incluyendo la detención del ciclo celular, activación de la transcripción, reparación de daños en el ADN, y la apoptosis o senescencia (Figura 1). Cuando el ADN está dañado, no activa los resultados de punto de control de daño del ADN en UNREPdaños al aire y, posteriormente, la inestabilidad genómica. El estudio del puesto de control el daño del ADN aclarará cómo las células mantener la integridad genómica y proporcionar un mejor entendimiento de cómo las enfermedades humanas, tales como el cáncer, desarrollar. Xenopus laevis extractos de huevo se están convirtiendo en un poderoso sistema libre de células modelo de extracto en la investigación puesto de control de daños en el ADN. Baja velocidad extracto (LSE) fue descrito inicialmente por el grupo Masui 1. La adición de cromatina de los espermatozoides demembranated a los resultados de LSE en la formación de núcleos cuando el ADN se replica de manera semiconservativa una vez por ciclo celular. El puesto de control vía de señalización ATR/Chk1-mediated es desencadenada por el estrés o daño en el ADN de replicación 2. Dos métodos se utilizan actualmente para inducir el punto de control de daño en el ADN: los enfoques que dañan el ADN y el ADN que imitan las estructuras de daños-3. Daño del ADN puede ser inducida por la radiación ultravioleta (UV), γ-irradiación, metilo metanonaesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS es un agente alquilante que inhibe la replicación del ADN y activa el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiación UV también provoca el daño del ADN 8 ATR/Chk1-dependent puesto de control. El daño en el ADN que imita la estructura AT70 es un complejo de recocido de dos oligonucleótidos poli-(dA) 70 y poli-70 (dT). El sistema AT70 fue desarrollado en el laboratorio Bill Dunphy y es ampliamente utilizada para inducir ATR/Chk1 señalización de punto de control 9-12. Aquí, se describen protocolos (1) para preparar extractos libres de células de huevo (LSE), (2) para el tratamiento de la cromatina de esperma de Xenopus con dos ADN diferentes enfoques dañar (MMS y UV), (3) para preparar el ADN daños que imita la estructura AT70, y (4) para activar el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated en LSE con cromatina de esperma dañado o una estructura que imita a daño en el DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus huevo extracto es un sistema modelo útil para investigar el punto de control de daño en el DNA. Este protocolo es para la preparación de extractos de huevo de Xenopus y reactivos de punto de control de daño de ADN que inducen. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN en el estudio de la señalización de punto de control de daño de ADN.

Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em&gt; Xenopus</em&gt; Extractos de huevo

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Los estímulos generados por ordenador Modelo animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...