Name: study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av medel från University of North Carolina i Charlotte, Wachovia stiftelse fond för lärare kompetens, och ett bidrag från NIGMS (R15GM101571).

1. LSE Förberedelse <ol><li> Kvinnliga grodor (Xenopus laevis) injiceras två gånger för insamling av ägg. Den första injektionen (priming) är 100 U PMSG (gravid Mare Serum Gonadotropin) per groda. Grodor måste fyllas minst två dagar innan inducera äggläggning och primade grodor är användbara i upp till två veckor. För prime grodor, injicera PMSG subkutant i den dorsala lymfan säckar med en 3 ml spruta och 27 G nål. </li><li> För att inducera äggläggning, injicera 500 U hCG (humant koriongo...

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Det finns flera fördelar med att studera checkpoint DNA-skador med Xenopus ägg extrakt. Användningen av ägg extrakt ger en stor mängd av cellfria extrakt synkroniserade vid interfasen av cellcykeln. De ägg extrakt kan enkelt och billigt göras. Det är relativt lätt att skada DNA eller kromatin och att avslöja en defekt i DNA-skador kontrollpunkt efter immunodepleting ett målprotein från äggextrakt. Därefter kan en potentiell funktion defekt vara &quot;räddas&quot; genom addback av vildtyp eller mu...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344-antikropp </td><td> Cellsignalering </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Chk1 antikropp </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cykloheximid </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytokalasin B </td><td> EMD </td><td> 250.233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metylmetansulfonat (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129.925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nokodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2 mg </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367.222 </td><td></td></tr><tr><td> Provbuffert </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> Hink för äggläggning </td><td> Rubbermaid kommersiella produkter </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC centrifug med svängande hink rötor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 svängande hink rotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11.860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 plus SuperSpeed ​​centrifug </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46.910 </td><td></td></tr><tr><td> UV-tvärbindare </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösningar </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaClj 2, 5 mM HEPES, justera pH till 7,8 med 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / Leupeptin lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml vardera i vatten. Lagra 20 il alikvoter vid -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffert X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M sackaros, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgClz 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, justera pH till 7,5 med HCl </td></tr><tr><td> Cykloheximid lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml i vatten. Store 1 ml alikvoter vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytokalasin B beståndet </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml i DMSO. Lagra 20 il alikvoter vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) lager </td><td></td><td></td><td> 1 M i vatten. Store 1 ml alikvoter vid -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M sackaros, 1 mM DTT, 50 pg / ml cykloheximid, 2,5 mM MgClz 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nokodazol lager </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml i DMSO. Lagra 5 | il alikvoter vid -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energi Blandning </td><td></td><td></td><td> 375 mM kreatinfosfat, 50 mM ATP och 25 mM MgCb 2. Alikvoter sparas vid -80 ° C. </td></tr><tr><td> Nuclear färglösningen </td><td></td><td></td><td> 0,4 pg / ml Hoechst 33258, 25% glycerol(Volym / volym), i 1 x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin lager </td><td></td><td></td><td> 100 pM i DMSO. Lagra 10 il alikvoter vid -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

På en daglig basis, celler utsätts för en mängd av endogena och miljömässiga förolämpningar. För att bekämpa dessa förolämpningar har celler utvecklats checkpoint DNA-skada signalering som en övervakningsmekanism för att känna DNA-skador och direkta cellulära svar på DNA-skador. Det finns flera grupper av proteiner som kallas sensorer, givare och effektorer involverade i DNA-skador kontrollpunkt signalering (figur 1). I denna komplexa signalväg är ATR (ATM och Rad3-relaterade) ett av de största kinaser som kan svara på DNA-skador och replikering stress. Aktiverad ATR kan fosforylera dess nedströms substrat såsom Chk1 (Checkpoint kinas 1). Därför fosforylerat och aktiverad Chk1 leder till många nedströms effekter i DNA-skador checkpoint, inklusive cellcykelstopp, transkriptionsaktivering, DNA-skador reparation och apoptos eller senescens (figur 1). När DNA skadas, om att aktivera DNA resulterar skada kontrollpunkt i unrepsändes skada och därefter genomisk instabilitet. Studien av DNA-skador kontrollpunkten kommer belysa hur celler upprätthåller genomisk integritet och ge en bättre förståelse för hur mänskliga sjukdomar, såsom cancer, utvecklas. Xenopus laevis ägg extrakt växer fram som en kraftfull cellfritt extrakt modellsystem i DNA-skador kontrollpunkt forskning. Låg hastighet extrakt (LSE) ursprungligen beskrivs av Masui grupp 1. Tillsatsen av demembranated spermier kromatin till LSE resulterar i kärnor bildas där DNA replikeras i en semiconservative sätt en gång per cellcykeln. Den ATR/Chk1-mediated Checkpoint signalväg utlöses av DNA-skada eller replikering stressen 2. Två metoder används idag för att inducera Checkpoint DNA-skador: DNA-skadande metoder och DNA-skador, härma strukturer 3. DNA-skada kan induceras genom ultraviolett (UV) strålning, γ-strålning, metyl metanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitrokinolin-1-oxid (4-NQO), eller afidikolin 3, 4. MMS är ett alkyleringsmedel som hämmar DNA-replikation och aktiverar ATR/Chk1-mediated DNA-skada kontrollpunkt 4-7. UV-strålning utlöser också ATR/Chk1-dependent DNA-8 skador kontrollpunkt. Den DNA-skada-imitera strukturen AT70 är en glödgad komplex av två oligonukleotider poly-(dA) 70 och poly-(dT) 70. Det AT70-systemet utvecklades i Bill Dunphy laboratorium och används ofta för att framkalla ATR/Chk1 checkpoint signalering 9-12. Här beskriver vi protokoll (1) att förbereda cellfria ägg extrakt (LSE), (2) att behandla Xenopus spermier kromatin med två olika DNA skada metoder (MMS och UV), (3) att förbereda DNA-skador, imitera struktur AT70, och (4) att utlösa ATR/Chk1-mediated kontrollpunkt DNA-skador i LSE med skadad sperma kromatin eller en DNA-skada-imitera strukturen.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus ägg extrakt är en användbar modell för att undersöka Checkpoint DNA-skador. Detta protokoll är för beredning av Xenopus ägg extrakt och DNA skador checkpoint reagens inducerande. Dessa tekniker är anpassningsbara till en mängd olika DNA-skadande tillvägagångssätt i studien av DNA-skada kontrollpunkt signalering.

Studie av DNA Damage Checkpoint med<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extrakt

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Använda Fraktionerade Xenopus Egg Utdrag

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Gödsling av Xenopus oocyter Med metoden Host Transfer

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Ägg extrakt för att identifiera mikrotubuli-associerade RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstitution av β-catenin nedbrytning i<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Utdrag

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur<em&gt; In situ</em&gt; Använda TUNEL metoden

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...