Name: blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

De auteurs willen graag de GWU Harlan Fellowship erkennen voor de ondersteuning van Paaqua Grant en de GWU Luther Rice Fellowship voor ondersteuning van Mona Herold. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie ​​MCB-1121711.

1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en Gerechten <ol><li> Verscherpen vier tang met behulp van Alumina schurende film. Doe dit onder een dissectiemicroscoop aan het uiteinde formaat te controleren. Een pincet dient als back-up bij een tip wordt beschadigd tijdens de procedure. Autoclave vier forceps en bewaar in een steriele container. </li><li> Maak 500 ml elk van 0,1 x en 1,0 x kweekmedium (ofwel Marc&#39;s gemodificeerd Ringers [MMR] of zoutoplossing Gewijzigd Barth&#39;s [MBS]; recepten in 15)</s...

<ol>
	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

De belangrijkste stappen voor een succesvolle kweken van afzonderlijke blastomeren zijn: 1) het identificeren van de juiste plaats blastomeer, 2) het behoud van een steriele, gezonde cultuur 3) ontleden cellen op het juiste deel van de celcyclus en 4) de noodzakelijke handmatige behendigheid om beschadiging tijdens dissectie en goed te dragen aan de cultuur. Te manipuleren specifieke blastomeren is essentieel om de assen kardinaal identificeren. In Xenopus embryo kan de rugzijde wor...

Xenopus laevis embryo&#39;s zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen die embryonale cellen krijgen hun specifieke lot omdat hun eieren groot genoeg om microchirurgische benaderingen mogelijk identificeren. Bovendien ontwikkelen ze buiten zonder voedingssupplementen van het kweekmedium omdat elke cel een rijke intracellulaire levering van dooier bloedplaatjes die een intrinsieke energie store. Een belangrijk voordeel voor het bestuderen van de mechanismen waarmee lot van de cel wordt bepaald is een uitgebreide reeks lot kaarten van de splitsing fase blastomeren (van 2 - tot 32-cell fasen) 1, 2, 3, 4, 5, 6. De kaarten werden geconstrueerd door microinjecting een detecteerbaar molecuul in een, identificeerbaar blastomeer en controle later in ontwikkeling die weefsels worden bevolkt door de gemerkte nageslacht. Consistent lot kaarten zijn mogelijk omdat de kardinaal assen van de embryo betrouwbaar kan worden geïdentificeerd in vele Embryos. Ten eerste, in alle wild-type embryo&#39;s het dier halfrond is gepigmenteerd, terwijl de plantaardige halfrond is het niet. Anderzijds de ingang van het sperma bij bevruchting vindt een contractie van het dier halfrond pigmentatie naar de toekomst buikzijde, in veel embryo&#39;s een pigmentatie verschil kan daarom gebruikt worden om onderscheid te maken tussen dorsale en ventrale kanten. Derde, de eerste splitsplek vore benadert het sagittale middenvlak in de meeste embryo&#39;s, en kan dus worden gebruikt om de rechter-en linkerzijde van de embryo identificeren. Het lot kaarten zijn ook afhankelijk van het feit, dat op natuurlijke wijze bevruchte eieren vaak aankleven in regelmatige patronen die elke blastomeer identificeerbare over een grote populatie van embryo&#39;s. Hoewel er variabiliteit binnen en tussen legsels van eieren ten aanzien van pigmentatie en decollete patronen, met behulp van selectieprocedures die hierin worden beschreven kunnen cellen met voorgeschreven lot te worden geïdentificeerd met ongeveer 90% nauwkeurigheid. Celtypes kunnen afschrikkenbepaald tijdens embryogenese door verschillende mechanismen. Intrinsieke factoren, zoals erfelijke differentieel cytoplasmatische mRNA of eiwitten, bijdragen tot verschillende aspecten van vroege patronen. Bijvoorbeeld specifieke maternale mRNA bepalen welke cellen bijdragen aan de kiemlijn, worden de endoderm, of bijdragen aan de dorsale lichaamsas (beoordeeld in 7). Extrinsieke factoren lokaal door naburige cellen of verder af van een embryonale signalering centrum verantwoordelijk voor het induceren van specifieke weefselsoorten en patroonvorming vrijwel elk orgaansysteem. Voorbeelden van signalering centra zijn ook de organisator / node in de gastrula dat de neurale ectoderm en patronen het mesoderm induceert, en de zone van polariserende activiteit die patronen van de anterior-posterior as van de ledematen. Hoewel lot maps identificeren voorlopers van de verschillende organen en onthullen de ontwikkeling weg die hun nakomelingen in normale embryo, kunnen ze geen onderscheid tussen intrinsiekeen extrinsieke invloeden op deze cellen. Ook blijkt dat er geen volledige ontwikkeling van een cel, die nakomelingen differentiëren in het complex signaleren omgeving van de embryo. Twee experimentele benaderingen kunnen testen of een cel lot bepaald door intrinsieke factoren of daarna beïnvloed door externe factoren: 1) transplantatie van de cel naar een nieuwe locatie in het embryo, of 2) verwijderen van de cellen van de embryo, gevolgd door kweek in afwezigheid van exogeen signalen. Beide experimentele benaderingen zijn mogelijk in Xenopus omdat de cellen groot genoeg om handmatig gescheiden. Zo hebben vele studies verwijderd enkele cellen van embryo&#39;s (tot cel-cel interacties veranderen) of getransplanteerde cellen op nieuwe plaatsen in ontvangende embryo&#39;s testen lot veranderingen (beoordeeld in 7, 8, 9). Bovendien de tweede benadering van explanteren kleine aantallen cellen van verschillende gebieden van de embryo into cultuur inductieve weefsel interacties in de afwezigheid van exogene factoren verduidelijken is mogelijk omdat de cellen van het Xenopus embryo zijn gevuld met een intracellulaire voedingsstof store, de dooier bloedplaatjes. Daarom kunnen ze worden gekweekt een paar dagen in een gedefinieerd medium zonder zout nutritioneel of groeifactor aanvulling van het kweekmedium. Wij hebben deze benadering te laten zien dat dorsale dier blastomeren een autonome vermogen om neurale en dorsale mesodermale weefsels door maternaal overgeërfd mRNAs 10, 11 produceren en anderen aangetoond dat mesoderm specificatie van 32-cell blastomeren gebeurt zowel intrinsieke als extrinsieke informatie 12 . Een voordeel van het kweken van cellen als explantaten is dat het medium ook kan worden aangevuld met gedefinieerde signaalfactoren te bepalen welke cel-tot-cel communicatie pathway kan het lot van de geëxplanteerde cel 12, 13, 14 beïnvloeden. Daarnaast kan men injecteren de blastomeer prior om cultuur mRNA tot overexpressie een gen, of anti-sense oligonucleotiden de vertaling van endogene mRNA&#39;s te voorkomen. Deze, winst-en verlies-van-functie analyses kunnen bepalen welke moleculen nodig zijn voor een autonoom uitgedrukt lot. Het lot van het explantaat te analyseren, kan de identificatie van specifieke celtypen worden uitgevoerd door standaard genexpressie (bijvoorbeeld in situ hybridisatie, RT-PCR) en immunocytochemische assays. Dit protocol biedt een eenvoudige, maar krachtige, manier om onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke mechanismen die regelen hoe een embryonale cel zich ontwikkelt tot specifieke weefsels.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-38 </td><td> Cursus (12 micrometer), voor groot onderhoud van een tang tips </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-46 </td><td> Medium (3 pm) voor fijn slijpen van forceps tips </td></tr><tr><td> Alumina schurende film </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 micrometer), voor het polijsten van de verlostang tips </td></tr><tr><td> Pincet: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 11.252-30 </td><td> Deze hebben de fijne tips die het niet nodig worden geslepen, wanneer het eerst kocht. Corrosiebestendige, zodat ze kunnengeautoclaveerd worden. </td></tr><tr><td> Gentamicine oplossing </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Toevoegen aan medium op dezelfde dag als het gebruik </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Fate kaarten opgebouwd uit stam tracering alle cellen van een embryo, blijkt dat weefsels afstammen van elke cel van de embryo. Hoewel lot kaarten zijn zeer nuttig voor het identificeren van de voorlopers van een orgaan en voor het ophelderen van de ontwikkelingstraject waarbij de afstammeling cellen die organen bevolken de normale embryo, ze illustreren de volledige ontwikkelingspotentieel van een precursor cel of identificeren mechanismen waarmee het lot bepaald. Om te testen voor lot van de cel inzet, men vergelijkt een cel normale repertoire van nakomelingen in het intacte embryo (het lot kaart) met die uitgedrukt na een experimentele manipulatie. Is de cel het lot bepaald (vastgelegd), ongeacht de omringende cellulaire omgeving, of is het beïnvloed door externe factoren die door zijn buren? Met behulp van de uitgebreide lot kaarten van de Xenopus embryo beschrijven we hoe te identificeren, isoleren en cultuur een decollete stadium precursoren, genoemd blastovennen. Deze benadering maakt het mogelijk om te beoordelen of deze eerste cellen zijn toegewijd aan het lot zij in hun normale omgeving verwerven in het intacte embryo vereisen interacties met naburige cellen, of kan worden beïnvloed alternatieve lot drukken bij blootstelling aan andere soorten signalen.

Het vermogen van deze assay goed te beoordelen ontwikkeling van de cel berust op de juiste ontleden blastomeer gebaseerd op het lot kaarten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daarom is het essentieel om embryo&#39;s te kiezen met de juiste pigmentatie patroon op de 2-cel stadium, zoals geïllustreerd in figuur 1, die vervolgens overeenstemming regelmatig splitsingspatronen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Als men neemt de gesorteerd embryo&#39;s bij het bereiken van de vereiste decollete po...

Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de ziekte van Parkinson

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Cultuur en onderhoud van menselijke embryonale stamcellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Invriezen en ontdooien van menselijke embryonale stamcellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...