Name: blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00
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著者はモナヘロルドのサポートのためのPaaquaグラントとGWUルーサーライスフェローシップのサポートのためGWUハーラン·フェローシップを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団助成MCB-1121711によってサポートされていました。

1。器具、培地や料理の準備<ol><li>アルミナ研磨フィルムを使用して4鉗子を強めています。チップサイズを監視するために解剖顕微鏡下でこれを行います。先端が処置中に損傷している場合には鉗子1組のバックアップとして機能します。すべての4つの鉗子をオートクレーブ滅菌した容器に保管してください。 </li><li> （; 15のレシピどちらMarcの修正リンガー[MMR]または改変バルトの?...

<ol>
	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

ほとんどの個々の割球の培養に成功するための重要なステップは次のとおりである：1）正常に関心の割球を識別する、2）滅菌した、健全な文化を維持すること、3）細胞周期の正しい部分の解剖細胞、​​4）必要なマニュアルを開発解剖や文化への転送だけでなく時の損傷を防止するための器用さ。 特定の割球を操作するには、カーディナルの軸を識別できることが不?...

アフリカツメガエルの胚は、その卵が顕微鏡のアプローチを可能にするのに十分な大きさであるため、胚細胞がその特定の運命を獲得するメカニズムを識別するために広く利用されてきた。各セルには固有エネルギーストアを提供卵黄血小板の豊富な細胞内の供給が含まれているため、さらに、彼らは、培地の栄養補給を必要とすることなく、外部から開発しています。 1、2、3、4、5、6 -細胞の運命が決定されるメカニズムを研究するための重要な資産は、（32セルステージ2〜から）卵割期の割球の運命マップの包括的なセットです。これらのマップは、組織が標識された子孫が移入され、開発の後半にある単一の識別可能な割球および監視に検出可能な分子をマイクロインジェクションすることにより構築した。胚の枢機卿軸は確実に多くのエンブリーで同定することができるため、一貫性のある運命のマップが可能ですOS。植物半球ではないのに対し、第一に、すべての野生型胚において動物半球は、色素沈着です。第二に、受精時の精子のエントリは、将来の腹側に向かって動物半球の色素沈着の収縮を引き起こし、多くの胚では色素沈着の差が故に背側と腹側の側面を区別するために使用することができます。第三に、第一分裂溝は、ほとんどの胚における半ば矢状面を近似し、その結果胚の左右を識別するために使用することができます。運命マップも胚の大規模な人口全体の各割球が識別できるように規則的なパターンで自然に受精卵が頻繁に開裂するという事実に依存しています。内および色素沈着および切断パターンに関する卵のクラッチの間にばらつきがあるが、本明細書に記載の選択手順を使用すると、所定の運命を有する細胞が約90％の精度で識別することができます。 細胞の運命が決定することができますいくつかのメカニズムで胚発生時の採掘。そのような差別的継承細胞質mRNAまたはタンパク質などの本質的な要因は、早期のパターニングのいくつかの側面に貢献しています。たとえば、特定の母性mRNAは細胞は、生殖系列に寄与する内胚葉になったり、背側体軸（7日）に寄与するかを決定します。胚の情報伝達の中心から隣接セル以上の遠縁でローカルに提供外因性の要因は、ほぼすべての臓器系の特定の組織の種類とパターン形成を誘導するための責任を負うものとします。シグナリングセンターの例には、神経外胚葉と中胚葉のパターンを誘発原腸胚におけるオーガナイザー/ノード、および肢芽のパターンは前後軸という活動を偏光の帯があります。運命マップが異なる器官の前駆体を識別し、正常な胚でその子孫によって取ら発達経路を明らかにするが、それらは本質的な区別はできませんそして、それらの細胞に外因性の影響。彼らはまた、子孫胚の複雑な信号環境において分化細胞の完全な発達の可能性を明らかにしない。で培養した胚に由来する細胞の除去または2）;小説胚の場所に）1細胞の移植：2つの実験的なアプローチは、細胞の運命は、内因性の要因によって決定されたか、後に外部の要因によって影響されているかどうかをテストすることができます外因性シグナルの不在。 細胞が手動で分離するのに十分な大きさであるため、両方の実験的なアプローチは、 アフリカツメガエルで実現可能となっている。たとえば、多くの研究は、運命の変更（7日、8、9）をテストするために宿主胚における新規の場所に胚（細胞間相互作用を変更する場合）または移植された細胞からの単一細胞を削除しました。さらに、胚の異なる領域から細胞の数が少ないexplantingの第二のアプローチIアフリカツメガエル胚の細胞は、細胞内の栄養素ストア、卵黄血小板で埋められるため、外因性因子の非存在下で誘導組織の相互作用を解明するNTOの培養が可能です。したがって、彼らは、培地の栄養や成長因子の補充なしで定義された塩培地で数日間培養することができる。私たちは、その背の動物の球が母性遺伝mRNAが10、11に起因する神経と背側中胚葉組織を生成するために自律的能力を持っており、他は32細胞割球と中胚葉の仕様では、内因性及び外因性情報12の両方に依存して認められた表示するには、このアプローチを使用していた。外植体として、細胞を培養することの利点は、媒体は、外植セル12、13、14の運命に影響を及ぼす可能性のある細胞間の通信経路を決定するために定義されたシグナル伝達因子を補充することができることである。また、1割球はPRを注入することができます内因性mRNAの翻訳を防止するために過剰発現するmRNAの遺伝子を持つ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いた文化にIOR。これらは、ゲインとロス·オブ·機能解析は、自律的に発現して運命のために必要とされる分子を識別することができます。外植片の運命を分析するには、特定の細胞種の同定は標準の遺伝子発現（ 例えば、in situハイブリダイゼーション 、RT-PCR）と免疫細胞化学的ア ​​ッセイにより行うことができる。このプロトコルは、胚細胞が特定の組織に発展する方法を制御内因性および外因性のメカニズムを区別するための簡単​​かつ強力な方法を提供します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-38 </td><td>鉗子先端部の大規模修繕のためのコース（12μm）であり、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-46 </td><td>鉗子先端のシャープ罰金のための媒体（3μm）を、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-54 </td><td>鉗子先端の研磨のためのファイン（0.3μm）を、 </td></tr><tr><td>鉗子：デュモン、Dumoxel Biologie＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃11252から30 </td><td>これらは、最初の購入時に鮮鋭化を必要としない微細なヒントがあります。耐腐食性、彼らがそうすることができるので、オートクレーブする。 </td></tr><tr><td>ゲンタマイシンソリューション</td><td>シグマ</td><td> G1397 </td><td>使用と同じ日に培地に入れる</td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

胚の細胞のすべてをトレース系統から構築運命マップは、組織は、胚の各セルから派生しているが明らかになった。運命マップは臓器の前駆体を識別するための、子孫細胞は正常な胚に、その臓器を移植それによって発達経路を解明するために非常に有用であるが、それらは、前駆細胞の完全な発達の可能性を説明したりするメカニズムを特定することはありませんその運命が決定される。細胞運命のコミットメントをテストするためには、実験的操作後に発現したものと無傷の胚（運命マップ）に子孫の細胞の正常なレパートリーを比較します。細胞の運命は、周囲の細胞環境にかかわらず、（コミット）が固定され、またはそのネイバーが提供する外部要因によって、それに影響を与えていますか？ アフリカツメガエル胚の包括的な運命マップを使用して、我々が識別する方法について説明し、隔離し、文化の単一卵割期の前駆体、blasto呼ばミアズ。このアプローチは、1つは、これらの初期の細胞は、彼らがそれらの隣接細胞との相互作用を必要とし、無傷の胚内でそれらの通常の環境で取得運命にコミットしている、または他のタイプの信号にさらされた場合、代替の運命を表現するために影響を受ける可能性があるかどうかを評価することができます。

正確に細胞の発生能を評価するために、このアッセイの能力は運命マップ1、2、3、4、5、6に基づいて、適切な割球を解離に依存している。したがって、それは続いて、 図2に示すように、定期的な切断パターンに準拠し、 図1に示すように、2細胞期に正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが重要です。一つは、彼らが必要な切断段階に達するよう?...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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ヒト胚性幹細胞を凍結融解

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

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遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

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胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

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