Name: blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить признательность GWU Харлан стипендий для поддержки Paaqua Грант и GWU Лютер Райс стипендий для поддержки Мона Herold. Эта работа была выполнена при поддержке Национального научного фонда грант MCB-1121711.

1. Подготовка инструментов, культура, СМИ и посуда <ol><li> Резкость четыре щипцы использованием глинозема абразивной пленкой. Делайте это под рассекает микроскопом, чтобы контролировать размер чаевых. Одна пара щипцов служит в качестве резервного в случае, если наконечник поврежден во в...

<ol>
	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

Наиболее важных шагов для успешного культивирования отдельных бластомеров являются: 1) правильность определения бластомеров интересов; 2) поддержание стерильной, здоровой культуры, 3) рассекает клеток при правильной частью клеточного цикла и 4) разработку необходимых руководства ловк?...

Xenopus Хепориз эмбрионов были использованы широко определить механизмы, с помощью которых эмбриональные клетки приобретают их конкретными судьбами, потому что их яйца являются достаточно большими, чтобы позволить микрохирургического подхода. Кроме того, они развиваются внешне без необходимости использования пищевых добавок в культуральной среде, потому что каждая клетка содержит богатый внутриклеточного питания тромбоцитов желток, которые обеспечивают внутренний запас энергии. Важным преимуществом для изучения механизмов, посредством которых клетки судьбу определяют это полный набор карт судьбы бластомеров на стадии дробления (от 2 - до 32-клеточной стадии) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Эти карты были построены microinjecting обнаружены молекулы в одну, идентифицируемые бластомеров и контроль позднее в развитие которого тканей населенных меченых потомства. В соответствии Карты судьбы возможны, потому что кардинальных осей эмбрионы могут быть надежно выявлены во многих ЭмбриОС. Во-первых, во всех эмбрионов дикого типа животных полушария пигментированные, в то время вегетативного полушария не является. Во-вторых, вступление сперма при оплодотворении вызывает сокращение пигментации животных полушария в будущее брюшной стороны, во многих эмбрионов пигментации разницы, следовательно, может быть использована для различия между спинной и брюшной сторон. В-третьих, первой борозды дробления приближается к середине сагиттальной плоскости в большинстве эмбрионов, и, следовательно, может быть использована для определения правой и левой сторон эмбриона. Судьба карты также рассчитывать на то, что, естественно оплодотворенные яйца часто расщепляют в закономерности, которые делают каждого бластомеров идентифицируемые по большому населения эмбрионов. В то время как изменчивость внутри и между кладки яиц в отношении пигментации и расщепление моделей, с использованием процедур отбора, описанные здесь позволяет клеткам с заданными судьбы должны быть определены с 90% точностью. Сотовые судьбы может быть определенадобываются во время эмбриогенеза несколько механизмов. Внутренние факторы, такие как дифференциально унаследовал цитоплазматических мРНК или белков, способствуют некоторые аспекты раннего паттерна. Например, конкретных материнских мРНК определить, какие клетки будут способствовать зародышевой линии, становятся энтодермы, или вклад в спинной оси тела (обзор 7). Внешние факторы при условии, локально соседними клетками или более отдаленно от центра эмбриональных сигнализации, несут ответственность за склонение конкретные типы тканей и структурирование почти каждый орган системы. Примеры сигнализации центры включают в себя организатором / узел в гаструлы, что вызывает нервные эктодермы и мезодермы моделей, и в зоне поляризующей активности, что модели передне-задней оси конечности почки. Хотя судьба карты выявления предвестников различных органов и выявить пути развития, принятых их потомков в нормальный эмбрион, они не могут различать внутреннююи внешние воздействия на эти клетки. Они также не раскрывают полный потенциал развития клетки, чьи потомки дифференцироваться в комплексе сигнальную среду эмбриона. Два экспериментальных подходов можете проверить судьбу клетки определяется внутренним факторам или в дальнейшем под влиянием внешних факторов: 1) трансплантации клетки к новому расположению в зародыше, или 2) удаление клеток из эмбрионов последующей культуры в отсутствие экзогенных сигналов. Оба экспериментальных подходов было возможно в Xenopus, потому что клетки являются достаточно большими, чтобы вручную разделить. Например, многочисленные исследования были удалены отдельные клетки из эмбрионов (для изменения межклеточных взаимодействий) или пересаженных клеток к новым мест в принимающих эмбрионы, чтобы проверить на судьбу изменения (обзор в 7, 8, 9). Кроме того, второй подход культивирующий в искусственной среде небольшого числа клеток из различных регионов эмбриона яNto культуры выяснить индуктивных взаимодействий ткани в отсутствие внешних факторов, возможно потому, что клетки эмбрионов Xenopus заполнены внутриклеточных питательных магазине, желток тромбоцитов. Таким образом, они могут быть культивировали в течение нескольких дней в определенный солевой среде без питания или добавок фактор роста питательной среды. Мы использовали этот подход, чтобы показать, что спинной бластомеров животных имеют автономную способность производить нервные и спинного мезодермальных тканей из-за наследуется по материнской мРНК, 10, 11, и другие показали, что мезодерма спецификации 32-клетки бластомеры зависит как от внутренней и внешней информации 12 . Преимущество культивирования клеток в качестве эксплантов в том, что среда также может быть дополнен с определенными факторами сигнализации чтобы определить, какие клетки к клетке канал связи может повлиять на судьбу эксплантированных ячейки 12, 13, 14. Кроме того, можно вводить бластомеров пр.IOR к культуре с мРНК более-экспресс ген, или с антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы предотвратить перевод эндогенной мРНК. Эти, усиления и потерей функции анализа можно определить, какие молекулы, необходимые для автономного выразил судьба. Для анализа судьбы эксплантов, выявление специфических типов клеток может быть выполнена стандартная экспрессии генов (например, в гибридизация, RT-PCR) и иммуноцитохимических анализов. Этот протокол обеспечивает простой, но мощный, способ различать внутренние и внешние механизмы, которые регулируют как эмбриональная клетка развивается в определенных тканях.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> Alumina абразивных фильм </td><td> Томас Научные </td><td> # 6775E-38 </td><td> Курс (12 мкм), на капитальный ремонт советы щипцы </td></tr><tr><td> Alumina абразивных фильм </td><td> Томас Научные </td><td> # 6775E-46 </td><td> Средний (3 мкм), для тонкой заточки наконечников щипцов </td></tr><tr><td> Alumina абразивных фильм </td><td> Томас Научные </td><td> # 6775E-54 </td><td> Изобразительное (0,3 мкм), для полировки наконечников щипцов </td></tr><tr><td> Пинцет: Дюмон, Dumoxel Biologie № 5 </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> # 11252-30 </td><td> Они имеют тонкую советов, которые не требуют заточки, когда впервые купил. Коррозионной устойчивостью, чтобы они моглив автоклаве. </td></tr><tr><td> Гентамицин решения </td><td> Сигма </td><td> G1397 </td><td> Добавить в среде на тот же день, как использование </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Судьба карт, построенных по линии отслеживания всех клеток эмбриона, выявить, какие ткани происходят от каждой клетки эмбриона. Хотя судьба карт очень полезны для выявления предвестников органа и для выяснения развитии путь, по которому потомки клеток заполнения этого органа в нормальном эмбрионе, они не иллюстрируют полное развитие потенциала клеток-предшественников или определить механизмы, с помощью которых его судьба определяется. Для проверки ячейки обязательства судьбы, сравнить нормального репертуара клетки потомков в интактных эмбрионов (судьба карте) с теми, выраженное после экспериментальных манипуляций. Это судьба ячейки фиксированной (совершенные) независимо от окружающей среды сотовый, или это зависит от внешних факторов, предоставленных его соседей? Используя подробные карты судьбы эмбрионов Xenopus, мы расскажем, как выявление, изоляция и культуре одного прекурсоров стадии дробления, называют BlastoМерес. Такой подход позволяет оценить, являются ли эти ранние клетки полны решимости судьбы они приобретают в их обычной среде в неповрежденной эмбриона, требующих взаимодействия с соседними клетками, или можно влиять, чтобы выразить альтернативные судьбы при соприкосновении с другими типами сигналов.

Способность этого анализа, чтобы точно оценить потенциал развития клетки опирается на рассекающих из правильных бластомеров основан на судьбе 1 карт, 2, 3, 4, 5, 6. Поэтому, очень важно выбрать эмбрионов с правильной картины пигментации на 2-клеточной стадии, как показано на рисун?...

Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Судьба отдельных эмбриональные клетки может быть под влиянием унаследованного молекул и / или сигналов от соседних клеток. Используя судьба карты расщепления зародыше Xenopus, одной бластомеры могут быть определены для культуры в изоляции для оценки вклада наследственных молекул по сравнению с межклеточных взаимодействий.

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Оле Isacson: Разработка новых методов лечения болезни Паркинсона

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Видео биоинформатики Анализ человеческих эмбриональных роста клеток колонии стволовых

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Обратный генетический подход для тестирования функциональной избыточностью во время эмбриогенеза

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Одно отображение Судьба сотового у рыбок данио

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...