Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Vi vil gerne takke Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi og Kristina Wullimann for fremragende teknisk bistand. Vi takker W. Macklin til tilvejebringelse af PLP-GFP-mus. TM er støttet af Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), som Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), af Alexander-von-Humboldt-Fonden og den nationale bevilgende myndighed (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) inden for rammerne af ERA-Net neuron &quot;iPSoALS&quot; og &quot;2-foton billedbehandling&quot;. TM og MB understøttes af Center for Integreret Protein Science (München). PM blev støttet af Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis sterni Eksplantation (figur 1) Timing: 15 min. <ol><li> Forbered kirurgiske instrumenter: 2 par pincet, 1 saks, 1 par af foråret saks, 1 vævsdyrkningsskål (10-cm). Pre-boblet (minimum i 15 min) afkølet (4 ° C) Ringers opløsning med 5% CO2 / 95% O2. Fyld 15-cm vævsdyrkningsskål med is og dække det med metalplade. Forberede dissektion mikroskop og anbring den 15-cm skål med is under dissektion anvendelsesområdet for at afkøle...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

SC blegning metode, der præsenteres her er enkel, hurtig og alsidig: (i) Den gør det muligt at afsløre en enkelt SC morfologi og dynamik ved konfokal mikroskopi baseret på en enkelt transgen - hvilket er en betydelig fordel, når man kombinerer den tilgang med f.eks sygdomsmodeller, der kræver yderligere alleler . (Ii) Fremgangsmåden er hurtig, fra dissektion til fiksering den kan udføres på en halv dag. (Iii) Antallet af ansøgninger er bred, da det kan kombineres med andre metoder, såsom celle ablati...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Company (eksempel) </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> 70% (volumen / volumen) ethanolopløsning </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> i sprayflaske </td></tr><tr><td> isofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> andre godkendte bedøvelse kan anvendes til letal anæstesi </td></tr><tr><td> transgene mus (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> skal indhentes fra citerede kilder </td></tr><tr><td> dissektion mikroskop med kold-lys belysning </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> udstyret med Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> tang #2 </td><td> Fin Science Tools </td><td> 11.233-20 </td><td></td></tr><tr><td> tang # 5 </td><td> Fin Science Tools </td><td> 11.295-00 </td><td></td></tr><tr><td> saks, store medicinske </td><td> Fin Science Tools </td><td> 14.108-09 </td><td></td></tr><tr><td> saks, lille vinklet forår </td><td> Fin Science Tools </td><td> 15.033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in-line varmelegeme </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> opvarmning ring 3.5-cm skåle </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> to-kanals temperatur kontrolsystem </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusionssystem pumpesystem </td><td></td><td></td><td> specialbyggede </td></tr><tr><td> 15 cm vævsdyrkningsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> fyldt med is og dækket af metalplade </td></tr><tr><td> 10 cm vævsdyrkningsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> med oxygeneret Ringers opløsning </td></tr><tr><td> 3,5 cm vævsdyrkningsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> fyldt med Sylgard polymer </td></tr><tr><td> Sylgard polymer </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 silikoneelastomer Kit </td><td></td></tr><tr><td> konfokalt mikroskop </td><td> Olympus </td><td> FV1000 </td><td> med argonlaser </td></tr><tr><td> 50 ml reaktionsrør </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA i PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> kanyle 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> sprøjte 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptophysin antistof </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> kanin </td></tr><tr><td> sekundært antistof </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-brønds plade </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycin i PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> dækglas </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> dias </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien pins × 10 </td><td> Fin Science Tools </td><td> 26.002-20 </td><td> forkortet til &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin koblet til Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blokeringsopløsning </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% normalt gedeserum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer gennemboblet med 95% O2 / 5% CO2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCI </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mM KCI </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21.114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63.020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Specifikke reagenser og udstyr. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sekventiel fotoblegende giver en ikke-invasiv måde at mærke individuelle SCs på NMJ. Den NMJ er den største synapsen af ​​det mammale nervesystem og har fungeret som ledende model til at studere synaptisk struktur og funktion. I muse NMJs motor axon terminaler i kringle-lignende kontakt sites med muskelfibre. Motoren axon og dens terminal er beklædt med SCs. I de sidste årtier er adskillige transgene mus blevet genereret at visualisere motorneuroner og SCS, for eksempel Thy1-XFP 1 og PLP-GFP-mus 2, hhv. Langs motoriske axoner, er myelinerende axonale SCs anbragt i ikke-overlappende staengelled, adskilt af knudepunkter i Ranvier, så saltatory virkningspotentiale formering. I modsætning hertil er terminale SCs ved synapsen specialiserede gliaceller, der overvåger og fremme neurotransmission, fordøje debris og vejledning regenererende axoner. NMJs er tæt dækket med op til et halvt dusin ikke-myeldelse terminale SCs - disse imidlertid ikke individuelt løses ved lysmikroskopi, når de er i direkte kontakt med membranen 3. Adskillige fremgangsmåder eksisterer til individuelt at visualisere terminale SCs. Ingen af ​​disse er fejlfri, selv om. For eksempel kræver farvestof fyldning, hvis enkelte celler bliver spiddet med et farvestof fyldt mikroelektrode, ødelægger et mærket celle før fyldning af en anden. Dette er ikke foreneligt med efterfølgende tidsforskudte optagelser 3. Multispektral &quot;Brainbow&quot; mærkning af SCs er opnået ved hjælp af kombinatorisk ekspression af fluorescerende proteiner 4. Denne teknik kræver at kombinere flere transgener, og er begrænset af ekspressionsmønsteret af de anvendte promotorer. I fremtiden kan udtryk af &quot;foto-omstillelige&quot; proteiner i SCs være endnu et alternativ 5. Her præsenterer vi sekventiel fotoblegende, hvor enkelte celler bleges, og deres image fås ved subtraktion. Vi menerat denne tilgang - på grund af dens lethed og alsidighed - betegner en varig over neurolog teknologi paletten, især da den kan anvendes in vivo og overføres til andre celletyper, anatomiske steder eller arter 6. I det følgende protokol, detalje vi anvendelsen af ​​sekventielle blegning og efterfølgende konfokal time-lapse mikroskopi til terminal SCs i triangularis sterni muskel eksplantater. Denne tynde, overfladiske og nemt dissekeret nerve-muskel forberedelse 7,8 har vist sig anvendelige til undersøgelser af NMJ udvikling, fysiologi og sygdomslære 9. Endelig vil vi forklare hvordan den triangularis sterni musklen fremstilles efter fiksering at udføre korreleret høj opløsning konfokal billedbehandling, immunhistokemi eller ultrastrukturelle undersøgelser.

Et eksempel på en triangularis sterni eksplantat klar til billeddannelse parabol er vist i figur 1G. Dette eksplantat er især egnet til billeddannelse NMJs ex vivo som triangularis musklen kun består af et par lag af muskelfibre. Dette gør det muligt at opnå billeder med høj opløsning fra eksplantater afledt fra transgene muselinjer at fremhæve enten SCs (PLP-GFP 2) og / eller axoner (Thy1-XFP 1). Kritiske faktorer for høj billedkvalitet omfatter...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualisering individuelle celler i tætpakkede væv, såsom terminale Schwann-celler (SCS) i neuromuskulære junctions (NMJs), er udfordrende. &quot;Sekventiel fotoblegende&quot; tillader afgrænse enkelt terminal SCS, for eksempel i triangularis sterni muskel eksplantation, en bekvem nerve-muskel forberedelse, hvor sekventiel blegning kan kombineres med time-lapse imaging og<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sekventiel fotoblegende at afgrænse Single Schwann-celler ved den neuromuskulære overgang

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk registrering af suprathreshold neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissektion af Transversus Abdominis Muscle for Hele mount Neuromuskulære Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Påvisning af<em&gt; In Situ</em&gt; Protein-protein-komplekser på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction Brug Proximity ligeringsassayet

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantificering Matters: Karakterisering af fænotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Måling af neuromuskulære Junction funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch optagelser af Synaptic strømninger fra Drosophila larve neuromuskulære Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Enkelt-molekyle sporing på Drosophila præsynaptiske motoriske Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...