Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

We willen graag Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi en Kristina Wullimann bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken W. Macklin voor het verstrekken van PLP-GFP muizen. TM wordt ondersteund door het Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), door de Alexander-von-Humboldt-stichting en door de nationale financiering agentschap (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) in het kader van ERA-Net NEURON &quot;iPSoALS&quot; en &quot;2-foton beeldvorming&quot;. TM en MB worden ondersteund door het Centrum voor Geïntegreerde Protein Science (München). PM werd gesteund door de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni Explantatie (figuur 1) Timing: 15 minuten. <ol><li> Bereid chirurgische instrumenten: 2 paar tangen, 1 schaar, 1 paar van de lente schaar, 1 weefselkweek schotel (10-cm). Vooraf geborreld (minimum voor 15 min) gekoelde (4 ° C) Ringer&#39;s oplossing met 5% CO 2/95% O2. Vul 15-cm weefselkweek schotel met ijs en dek deze af met metalen plaat. Bereid dissectie microscoop en plaats de 15-cm schaal met ijs onder de scope dissectie om het expla...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

De SC bleken methode hier gepresenteerde is eenvoudig, snel en veelzijdig: (i) Het maakt onthullend enkele SC morfologie en dynamiek door confocale microscopie op basis van een enkel transgen - en dat is een belangrijk voordeel bij het ​​combineren van de benadering, die bijv. met de ziekte van modellen die extra allelen nodig . (Ii) De werkwijze is snel, zoals dissectie van de fixatie kan worden uitgevoerd in een halve dag. (Iii) Het aantal toepassingen is breed, als het kan worden gecombineerd met andere ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Bedrijf (voorbeeld) </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 70% (vol / vol) ethanol oplossing </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> in spray flacon </td></tr><tr><td> isofluraan </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> andere goedgekeurde verdoving kan worden gebruikt voor dodelijke anesthesie </td></tr><tr><td> transgene muizen (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> te worden verkregen uit bronnen aangehaald </td></tr><tr><td> dissectie microscoop met koud licht verlichting </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> met Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> tang #2 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forceps # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-00 </td><td></td></tr><tr><td> schaar, grote medische </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.108-09 </td><td></td></tr><tr><td> schaar, kleine schuine lente </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in-line heater </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> verwarming ring voor 3,5-cm schalen </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0.110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> tweekanaals systeem van de temperatuurcontrole </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344b </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusie pompsysteem </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15-cm weefselkweek schotel </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> gevuld met ijs en bedekt met metalen plaat </td></tr><tr><td> 10-cm weefselkweek schotel </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> met zuurstofrijk Ringer-oplossing </td></tr><tr><td> 3,5-cm weefselkweek schotel </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> gevuld met Sylgard polymeer </td></tr><tr><td> Sylgard polymeer </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 siliconelastomeerfase Kit </td><td></td></tr><tr><td> confocale microscoop </td><td> Olympus </td><td> FV1000 </td><td> met argon laser </td></tr><tr><td> 50 ml reactiebuis </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA in PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> canule 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml injectiespuit </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptofysine antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0.130 </td><td> konijn </td></tr><tr><td> secundair antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-well plaat </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycine in PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> dekglaasjes </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> dia&#39;s </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratoria </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien kunnen × 10 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-20 </td><td> verkort tot &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin gekoppeld met Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blokkeeroplossing </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% normaal geitenserum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% runderserumalbumine </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer geborreld met 95% O2 / 5% CO2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sequential foto-bleken is een niet-invasieve manier om afzonderlijke SC label aan de NMJ. De NMS is de grootste synaps van de zoogdieren zenuwstelsel en heeft gediend als leidraad model om synaptische structuur en functie te bestuderen. In de muis NMS motor axon terminals vormen krakeling-achtig contact sites met spiervezels. De motor axon en de terminal zijn ommanteld door SCS. In de afgelopen decennia zijn verschillende transgene muizen werden gegenereerd om motorneuronen en SC&#39;s te visualiseren, bijvoorbeeld Thy1-XFP 1 en PLP-GFP muizen 2, respectievelijk. Langs de motor axonen, worden myeliniserende axonale SC&#39;s gerangschikt in niet-overlappende internodiën, gescheiden door knopen van Ranvier, om sprongsgewijze actiepotentiaal voortplanting mogelijk te maken. In tegenstelling, terminal SC&#39;s op de synaps zijn gespecialiseerde gliale cellen, die te bewaken en te bevorderen neurotransmissie, verteren puin en gids regenererende axonen. NMS zijn strak gedekt door tot een half dozijn niet-myelinating terminal SC&#39;s - deze kunnen echter niet afzonderlijk worden opgelost door middel van lichtmicroscopie, omdat ze in direct contact membraan 3. Verschillende benaderingen bestaan ​​om individueel visualiseren terminal SC. Geen van deze zijn onberispelijk, dat wel. Bijvoorbeeld, kleurstof vullen, waarbij enkele cellen worden gespietst met een kleurstof gevulde micro-elektrode, vereist het vernietigen van een gelabelde cel alvorens in een tweede. Dit is niet compatibel met de volgende time-lapse opnames 3. Multispectrale &quot;Brainbow&quot; etikettering van SCS is bereikt door combinatorische expressie van fluorescerende eiwitten 4. Deze techniek heeft waarin verschillende transgenen en wordt begrensd door het expressiepatroon van de promoters gebruikt. In de toekomst zou expressie van &quot;photo-schakelbare&quot; eiwitten in SCS nog een andere alternatieve 5. Hier presenteren we sequentiële foto-bleken, waarbij enkele cellen worden gebleekt, en hun imago verkregen door aftrekking. Wij gelovendat deze benadering - vanwege het gemak en de veelzijdigheid - is een blijvende Naast technologie de neurowetenschapper palet, vooral omdat het kan worden gebruikt in vivo en overgebracht naar andere celtypen lokalisaties of soorten 6. In het volgende protocol, ingegaan op de toepassing van de sequentiële bleken en de daaropvolgende confocale time-lapse microscopie op klem SC&#39;s in triangularis sterni spier explantaten. Deze dunne, oppervlakkige en gemakkelijk ontleed zenuw-spier voorbereiding 7,8 nuttig is gebleken voor studies van NMJ ontwikkeling, fysiologie en pathologie 9. Tot slot leggen we uit hoe de triangularis sterni spier bereid is na fixatie uit te voeren gecorreleerd met een hoge resolutie confocale beeldvorming, immunohistochemie of ultrastructurele examens.

Een voorbeeld van een triangularis sterni explant gereed voor imaging schaal is weergegeven in figuur 1G. Dit explant is bijzonder geschikt voor imaging NMJs ex vivo als triangularis spier slechts bestaat uit een paar lagen van spiervezels. Dit maakt het verkrijgen van hoge resolutie beelden van explantaten uit transgene muizenlijnen die respectievelijk SCS (PLP-GFP 2) en / of axons (Thy1-XFP 1). Kritieke factoren voor hoge beeldkwaliteit omvatten: (i) vo...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. &quot;Sequential foto-bleken&quot; laat de afbakening van een enkele terminal SC&#39;s, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging en<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detectie van<em&gt; In Situ</em&gt; Eiwit-eiwit complexen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...