Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
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Nous tenons à remercier Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi et Kristina Wullimann d&#39;assistance technique excellente. Nous remercions W. Macklin pour fournir Plp-GFP souris. TM est soutenu par l&#39;Institut des hautes études (Technische Universität München), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), par la Alexander-von-Humboldt-Stiftung et par l&#39;organisme national de financement («Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) dans le cadre d&#39;ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS» et «2-photons d&#39;imagerie». MC et MB sont pris en charge par le Center for Integrated Protein Science (Munich). PM a été soutenue par la Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explantation (Figure 1) Timing: 15 min. <ol><li> Préparer les instruments chirurgicaux: 2 paires de pinces, 1 paire de ciseaux, 1 paire de ciseaux à ressort, 1 boîte de culture tissulaire (10 cm). Pré-bulles (minimum 15 min) refroidie (4 ° C) une solution de Ringer avec 5% de CO 2/95% O 2. Remplir 15 cm boîte de culture tissulaire avec de la glace et le couvrir avec une plaque métallique. Préparer microscope à dissectio...

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

La méthode de blanchiment SC présenté ici est simple, rapide et polyvalent: (i) Il permet de révéler la morphologie unique SC et la dynamique par microscopie confocale basée sur un seul transgène - ce qui est un avantage non négligeable lorsque l&#39;on combine l&#39;approche avec par exemple des modèles de maladies qui nécessitent des allèles supplémentaires . (Ii) Le procédé est rapide, à partir de dissection de fixation peut être effectuée en une demi-journée. (Iii) Le nombre de demandes es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société (exemple) </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Une solution d&#39;éthanol à 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en vaporisateur </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> tout autre anesthésique approuvé peut être utilisé pour l&#39;anesthésie mortelle </td></tr><tr><td> des souris transgéniques (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> être obtenue à partir de sources citées </td></tr><tr><td> microscope à dissection avec lumière froide éclairage </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> équipé d&#39;Schott KL LCD 1500 </td></tr><tr><td> pince #2 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forceps n ° 5 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, grand médicaux </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, petite coudée à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en ligne réchauffeur </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> chauffage anneau de 3,5 cm de plats </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> système à deux canaux de contrôle de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Système de pompe superfusion </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> rempli de glace et recouvert par une plaque métallique </td></tr><tr><td> 10 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> avec une solution de Ringer oxygénée de </td></tr><tr><td> 3,5 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> rempli avec du Sylgard polymère </td></tr><tr><td> Sylgard polymère </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Olympe </td><td> FV1000 </td><td> avec de l&#39;argon laser </td></tr><tr><td> Tube de réaction de 50 ml </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% dans du PBS PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Canule 0,5 x mm 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> seringue de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> anticorps synaptophysine </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> lapin </td></tr><tr><td> anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 0,01 M </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycine dans du PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> lamelles </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositives </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Laboratoires Vecteur </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> épingles minuties × 10 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td><td> abrégée &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-bungarotoxine couplé à Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de sérum de chèvre normal </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% de sérum albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sonneur barboter avec 95% O 2/5% de CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM de NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM de CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 1 mM </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs spécifiques et des équipements. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Séquentielle photo-blanchiment constitue un moyen non invasif d&#39;étiqueter SC individuels à la jonction neuromusculaire. Le MNJ est le plus grand des synapses du système nerveux des mammifères et a servi comme directeur de modèle pour étudier la structure et la fonction synaptique. Dans souris terminaux JNM axone moteur former des sites de contact bretzel comme avec des fibres musculaires. L&#39;axone moteur et sa borne sont gainés par SC. Au cours des dernières décennies, plusieurs souris transgéniques ont été générés pour visualiser les neurones moteurs et de SC, par exemple Thy1-XFP 1 et PLP-GFP souris 2, respectivement. Le long des axones moteurs, myélinisantes SC axonales sont disposées en se chevauchant pas noeuds, séparés par des nœuds de Ranvier, afin de permettre la propagation saltatoire potentiel d&#39;action. En revanche, SC terminaux à la synapse sont spécialisés cellules gliales, qui surveiller et de promouvoir la neurotransmission, digérer les débris et les guides axones. JNM sont hermétique jusqu&#39;à une demi-douzaine non myelnaires SC terminaux - ceux-ci, cependant, ne peuvent pas être résolus individuellement par microscopie optique, car ils sont en contact direct de la membrane 3. Plusieurs approches existent pour visualiser individuellement SC terminaux. Aucun d&#39;entre eux sont impeccables, bien. Par exemple, le remplissage de colorant, où les cellules isolées sont empalé avec une micro-électrode de colorant remplie, nécessite détruire une cellule marqué avant de le remplir une seconde. Ce n&#39;est pas compatible avec la suite enregistrements time-lapse 3. Multi-spectrale &quot;Brainbow&quot; étiquetage des castes a été réalisé en utilisant l&#39;expression combinatoire des protéines fluorescentes 4. Cependant, cette technique nécessite la combinaison de plusieurs transgènes et est limitée par le profil d&#39;expression des promoteurs utilisés. À l&#39;avenir, l&#39;expression de &quot;photo-commutables&quot; protéines dans SC pourrait être encore un autre 5 alternative. Ici, nous présentons photo-blanchiment séquentiel, où les cellules individuelles sont blanchis, et leur image obtenue par soustraction. Nous croyonsque cette approche - en raison de sa facilité et la polyvalence - représente un ajout à la palette de technologies durables de la neuroscientifique, en particulier car il peut être utilisé in vivo et transférés à d&#39;autres types cellulaires, sites anatomiques ou des espèces 6. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;application de la séquence de blanchiment et après confocale time-lapse de microscopie à SC terminaux dans des explants musculaires triangularis manubrium. Cette fine, superficielle et facilement disséquée préparation nerf-muscle 7,8 s&#39;est avéré utile pour les études de NMJ développement, la physiologie et la pathologie 9. Enfin, nous expliquons comment le muscle triangularis manubrium est préparé après la fixation d&#39;effectuer une corrélation à haute résolution imagerie confocale, immunohistochimie ou examens ultrastructuraux.

Un exemple d&#39;un explant triangularis sterni prêt pour l&#39;imagerie plat est illustré à la figure 1G. Cette explant est particulièrement adapté pour l&#39;imagerie JNM ex vivo que le muscle triangularis composée uniquement de quelques couches de fibres musculaires. Ceci permet d&#39;obtenir des images haute définition à partir d&#39;explants issus de lignées de souris transgéniques qui supporte clou SC (PLP-GFP 2) et / ou des axones (Thy1-XFP 1)....

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. &quot;Sequential photo-blanchiment&quot; permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d&#39;imagerie<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunomarquages.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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