Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
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私たちは、優れた技術支援にマヌエラBudak、Ljiljana MarinkoviとクリスティーナWullimannに感謝したいと思います。我々は、PLP-GFPマウスを提供するためのW·マックリンに感謝します。アレクサンダー·フォン·フンボルト財団、国家助成機関（ &quot;エリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung&quot;により、TMはドイツ学術振興（Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG）による高等研究所（ミュンヘン工科大学）によってサポートされています）ERA-Netのニューロン &quot;iPSoALS&quot;と &quot;2光子イメージング&quot;の枠インチTMとMBが統合蛋白質科学研究センター（ミュンヘン）によってサポートされています。 PMは、ミュンヘン工科大学（TUM-GS）の大学院によってサポートされていました。

1。オトガイ三角胸骨外植片（ 図1） タイミング：15分。 <ol><li>鉗子の2ペア、はさみの1ペア、春のはさみの1ペア、1組織培養皿（10センチ）：手術器具を準備します。 （15分間以上）事前バブリング冷却（4℃）を5％CO 2/95％O 2でリンゲル液。氷で15cmの組織培養皿を記入し、金属板とそれをカバーしています。解剖顕微鏡を準備し、解剖時に外植片を?...

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

ここに提示され、SC漂白方法は、簡単で高速かつ汎用性があります：（i）はそれは、単一の導入遺伝子をもとに共焦点顕微鏡によって、単一のSC形態とダイナミクスを明らかにすることができます-追加の対立を必要とする疾患モデルとアプローチなどを組み合わせたときに重要な利点である。解剖から固定には半日で行うことができるように（ii）の方法は、迅速である。それ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社（例） </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 70％（vol / vol）のエタノール溶液</td><td>ロート</td><td> T913.1 </td><td>スプレーボトルで</td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td> Forene、アボット</td><td></td><td>他の承認された麻酔薬を致死量の麻酔に使用することができます</td></tr><tr><td>トランスジェニックマウス（PLP-GFP） </td><td></td><td></td><td>引用した情報源から得られる</td></tr><tr><td>冷光照明を用いた解剖顕微鏡</td><td>オリンパスSZ51 </td><td></td><td> Schott社KL 1500液晶搭載</td></tr><tr><td>鉗子＃2 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11233から20 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から00 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、大規模な医療</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14108から09 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、小さな角度の春</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15033から09 </td><td></td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cmの皿のために加熱リング</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0110のDH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 2チャネルの温度制御システム</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td>灌流ポンプシステム</td><td></td><td></td><td>特注の</td></tr><tr><td> 15cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1803.003 </td><td>氷で満たされて、金属板で覆われて</td></tr><tr><td> 10cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1802.003 </td><td>酸素化リンゲル液と</td></tr><tr><td> 3.5 cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1800.003 </td><td>シルガードポリマーを充填</td></tr><tr><td>シルガードポリマー</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV1000 </td><td>アルゴンレーザーと</td></tr><tr><td> 50mlの反応管</td><td>ザルスタット</td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS中4％PFA </td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>カニューレ0.5ミリメートルX 25ミリメートル</td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td>注射器1ミリリットル</td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 18から0130 </td><td>ウサギ</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> - 11012 </td><td>アレクサ594 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01MのPBS </td><td>シグマ</td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS中の0.1 Mグリシン</td><td>ロート</td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutienピン×10 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から20 </td><td> &lt;4 mmに短縮</td></tr><tr><td> α-ブンガロトキシンアレクサ594に結合された</td><td> Invitrogen社（Molecular Probes社） </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ブロッキング溶液 </td></tr><tr><td> 0。01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2％トリトン-X100 </td><td>ロート</td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10％正常ヤギ血清</td><td>アブカム</td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1％ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> リンガー 95％O 2/5％CO 2でバブリング</td></tr><tr><td> 125 mMのNaCl </td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mMのKClを</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25mMののNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 MMのNaHCO 3 </td><td>シグマ</td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2mMのCaCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1mMのMgCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20mMグルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬や機器。 </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

光退色シーケンシャルNMJで個々のSCにラベルを非侵襲的な方法を提供します。 NMJは、哺乳動物の中枢神経系の最大のシナプスで、シナプスの構造と機能を研究するためのモデルを導く務めている。マウスNMJsモーター軸索末端の筋肉の繊維とプレッツェル状の接触部位を形成する。モーター軸索とその端子は、SCSによって覆われている。過去数十年にわたって、いくつかのトランスジェニックマウスは、それぞれTHY1-XFP 1、PLP-GFPマウス2例えば、運動ニューロンおよびSCを可視化するために生成されています。 運動軸索に沿って、軸索のミエリンSCは跳躍活動電位の伝播を可能にするために、ランヴィエ絞輪で区切られた、非重複節間に配置されている。これとは対照的に、シナプスの端末SCは監視と神経伝達を促進し、破片やガイド再生軸索を消化する特殊なグリア細胞である。 NMJsはしっかり半ダース非myelまでで覆われているターミナルSCをinating -彼らが直接膜接触3にあるように、これらは、しかし、個々に、光学顕微鏡では解決できません。 いくつかのアプローチは、個別の端末SCを可視化するために存在しています。これらのどれとはいえ、完璧なありません。例えば、単一の細胞が色素充填微小電極で突き刺さアール染料充填は、2つ目を充填する前に標識した細胞を破壊する必要があります。これにより、その後の時間経過の録音3と互換性がありません。 SCのマルチスペクトル&quot;Brainbow&quot;標識は、蛍光タンパク質の組み合わせ式4を使用することによって達成されてきた。しかし、この手法にはいくつかの導入遺伝子を組み合わせることが必要であり、使用されるプロモーターの発現パターンによって制限されます。将来的には、SCの中で&quot;光切替可能な&quot;タンパク質の発現は、さらに別の代替5かもしれない。ここでは、順次、光退色単一の細胞が漂白されている場所、および減算によって得られたそれらのイメージを提示する。我々は信じているこのアプローチという-その使いやすさと汎用性に起因する-それがインビボで使用され、他の細胞型、解剖学的部位や種6に転送することができ、特にとして、神経科学者の技術パレットに恒久加算を表しています。 オトガイ三角胸骨筋の外植片で端末のSCに、以下のプロトコルでは、我々は詳細漂白シーケンシャルおよびその後の共焦点タイムラプス顕微鏡法の適用を。これは、薄い表面的で簡単に解剖神経筋標本7,8 NMJ開発学、生理学、病理学9の研究のために有用であることが証明されました。最後に、我々はオトガイ三角胸骨筋が相関の高分解能共焦点イメージング、免疫組織化学や超微細構造検査を実行するために固定した後に準備される方法を説明します。

イメージング皿の準備オトガイ三角胸骨植片の例を図1Gに示されている。オトガイ三角筋は筋線維のいくつかの層からのみ構成されていますので、この外植片は、イメージングNMJs エクスビボのために特に適している。これは、いずれかのSC（PLP-GFPの2）および/ ​​または軸索（THY1-XFP 1）を強調するトランスジェニックマウス系統由来の外植?...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 &quot;シーケンシャル光退色&quot;漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、<em&gt;事後</em&gt;免疫染色。

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

の検出<em&gt;その場で</emで&gt;タンパク質 - タンパク質複合体<em&gt;ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用&gt;幼虫神経筋接合部

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...