Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
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우리는 우수한 기술 지원을위한 마뉴 Budak, Ljiljana Marinkovi와 크리스티나 Wullimann 감사드립니다. 우리는 PLP-GFP 마우스를 제공하기 위해 W. 맥클린 감사드립니다. 알렉산더 - 폰 - 훔볼트 재단에 의해, 그리고 국가 기금 기관 ( &quot;Bundesministerium 모피 Bildung 숙녀 Forschung&quot;로, TM은 독일 Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG)의 고급 연구 연구소 (Technische Universität 뮌헨)에 의해 지원됩니다 ) ERA-NET 뉴런 &#39;iPSoALS &quot;와&quot;2 광자 이미징 &quot;의 프레임 인치 TM과 MB가 통합 단백질 과학 (뮌헨)의 센터에 의해 지원됩니다. PM은 Technische Universität 뮌헨 (죽을 차례-GS)의 대학원에 의해 지원되었다.

1. Triangularis Sterni Explant (그림 1) 시간 : 15 분. <ol><li> 포셉 2 켤레, 가위 1 쌍, 스프링 가위 1 쌍, 1 조직 문화 요리 (10 cm) : 수술기구를 준비합니다. (15 분에 대한 최소) 미리 부풀어 오른 냉각 (4 ° C) 5 % CO 2 / 95% O 2 벨소리의 솔루션입니다. 얼음 15 cm 조직 문화 접시를 작성하고 금속 플레이트로 다룹니다. 해부 현미경을 준비하고 해부하는 동안 explant?...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

여기에 제시된 SC 표백 방법은 간단 신속하고 다양한입니다은 (i)는 하나의 transgene에 따라 공 촛점 현미경에 의해 단일 SC의 형태와 역학을 공개 가능 - 추가 대립 유전자를 필요로 질병 모델로 접근 예를 결합 할 때 상당한 장점 . 해부에서 고정으로 절반이 하루에 수행 할 수 있으므로 (ii) 본 방법은 빠른 것입니다. 이 같은 셀 ablations, 이미징 세포 소기관, 전기 생리학 또는 immunohistochemistry와...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 (예) </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 70 % (권 / 권) 에탄올 솔루션 </td><td> 로스 </td><td> T913.1 </td><td> 스프레이 병에 </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, 애보트 </td><td></td><td> 다른 승인 된 마취가 치명적인 마취 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 유전자 변형 마우스 (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> 인용 출처에서 획득 할 </td></tr><tr><td> 추위에 빛 조명과 해부 현미경 </td><td> 올림푸스 SZ51 </td><td></td><td> SCHOTT KL 1500 LCD가 장착 </td></tr><tr><td> 포셉 #이 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> 포셉 # 5 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> 가위, 대형 의료 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> 가위, 작은 각진 봄 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> 인라인 (in-line) 히터 </td><td> 워너 악기 </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cm 요리에 링을 가열 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 이 채널 온도 제어 시스템 </td><td> 워너 악기 </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion 펌프 시스템 </td><td></td><td></td><td> 주문품의 </td></tr><tr><td> 15 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> 얼음 가득과 금속 플레이트에 의해 적용 </td></tr><tr><td> 10 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> 산소 벨소리의 솔루션 </td></tr><tr><td> 3.5 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> Sylgard 폴리머로 가득 </td></tr><tr><td> Sylgard 폴리머 </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV1000 </td><td> 아르곤 레이저로 </td></tr><tr><td> 50 ML 반응 관 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS의 4퍼센트 PFA </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 캐뉼라 0.5 mm X 25mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 1 ML </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptophysin 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> 토끼 </td></tr><tr><td> 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> 알렉사 594 </td></tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td> 시그마 </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS에 0.​​1 M 글리신 </td><td> 로스 </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> coverslips </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien 핀 × 10 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-20 </td><td> &lt;4 mm까지 단축 </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin 알렉사 594에 커플 링 </td><td> Invitrogen (분자 프로브) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션을 차단 </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 % 트리톤 - X100 </td><td> 로스 </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% 일반 염소 세럼 </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1퍼센트 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 종을 울리는 사람 95% O 5분의 2 %의 CO 2 부풀어 오른 </td></tr><tr><td> 125 MM NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 MM KCl </td><td> 시그마 </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 MM 아뇨 2 PO 4 </td><td> 시그마 </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 MM NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 이 MM CaCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> 21,114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ㎜ MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> 63,020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 MM 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 장비. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

사진 표백 순서는 NMJ에서 개인 SCS에 라벨을 할 수있는 비 침습적 방법을 제공합니다. NMJ는 포유류의 신경계의 가장 큰 시냅스이며, 시냅스 구조와 기능을 연구 모델을지도로 제공하고 있습니다. 마우스 NMJs 모터 축삭 터미널에서 근육 섬유와 꽈배기 같은 연락처 사이트 구성합니다. 모터 축삭과 터미널 SCS에 끼 우고 있습니다. 지난 수십 년 동안, 여러 가지 유전자 변형 생쥐는 각각 Thy1-XFP 1 PLP-GFP 마우스 2 예를 들어, 모터 뉴런과 SCS를 시각적으로 생성되었습니다. 모터 axons 함께 myelinating axonal SCS는 약진 액션 잠재적 인 전파를 사용하려면, Ranvier의 노드로 구분하여 겹치지 internodes에 배치된다. 대조적으로, 시냅스에서 터미널 SCS는 모니터링 및 neurotransmission를 홍보 파편과 가이드 재생의 axons을 소화 전문 glial 세포입니다. NMJs는 단단 대여섯 비 myel까지이 적용됩니다터미널 SCS를 inating - 그들이 직접 멤브레인 연락처 세에 이러한 그러나, 개별적으로, 가벼운 현미경에 의해 해결 될 수 없습니다. 여러 접근법은 개별적으로 터미널 SCS을 시각화하기 위해 존재합니다. 이 중 어느 것도하지만, 완벽한 없습니다. 예를 들어, 하나의 세포가 염색이 가득한 microelectrode에 찔려 죽은 아르 염료 충전은 두 번째 하나를 작성하기 전에 표시된 셀을 파괴해야합니다. 이 이후의 시간 경과 녹음 3 호환되지 않습니다. SCS의 멀티 스펙트럼 &quot;Brainbow&quot;라벨은 형광 단백질의 조합 표현 사를 사용하여 달성되었습니다. 그러나,이 기술은 여러 transgenes을 결합 필요하며 사용 발기인의 표현 패턴에 의해 제한됩니다. 앞으로 SCS에서 &quot;사진 전환 가능한&quot;단백질의 표정은 또 다른 대안이 다섯 수 있습니다. 여기 순차 사진 표백 한 셀이 표백 곳, 그리고 빼기 얻은 자신의 이미지를 제시한다. 우리는 믿고이 접근하는 -의 편리함과 다양성으로 인해이 -이 생체에 사용하고 다른 세포 유형, 해부학 사이트 또는 종 6 이전 할 수 있습니다 특히 neuroscientist의 기술 팔레트에 지속적인 추가를 나타냅니다. triangularis sterni 근육의 explants에서 터미널 SCS에 대한 표백 순서와 후속 공 촛점 시간 경과 현미경의 다음 프로토콜에서, 우리는 세부 응용 프로그램을. 이, 얇은 표면 쉽게 해부하는 신경 근육 준비 7,8는 NMJ 개발, 생리와 병리 9 연구에 유용 입증되었습니다. 마지막으로, 우리는 고정 고해상도 공 촛점 이미징, immunohistochemistry 또는 ultrastructural 시험 상관 수행 한 후 triangularis sterni 근육이 준비 방법에 대해 설명합니다.

이미징 요리 준비 triangularis sterni의 explant의 예는 그림 1G에 표시됩니다. triangularis 근육이 근육 섬유의 몇 층으로 만 구성으로 explant는 영상 NMJs 예를 생체에 특히 적합합니다. 이 유전자 변형 마우스 라인에서 파생 explants에서 고해상도 이미지를 얻을 수 있도록하는 하이라이트 SCS (PLP-GFP 2) 및 / 또는 axons (Thy1-XFP 1) 중. 고품질 영상을위한 중요한 요?...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. &quot;선형 사진 표백&quot;표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수 있으며<em&gt; 후 특별</em&gt; immunostainings.

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

연구

신경과학

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

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검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

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Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

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Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

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Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...