Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann para assistência técnica excelente. Agradecemos W. Macklin para fornecer Plp GFP-ratos. TM é apoiada pelo Instituto de Estudos Avançados (Technische Universität München), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), pelo Alexander-von-Humboldt-Foundation e pela agência de fomento nacional (&quot;für Bildung und Bundesministerium Forschung&quot; ) no quadro da ERA-NET neurônio &quot;iPSoALS&quot; e &quot;imagem dois fótons&quot;. TM e MB são suportados pelo Centro de Ciência Proteína Integrado (Munique). PM foi apoiado pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1) Cronograma: 15 min. <ol><li> Prepare instrumentos cirúrgicos: 2 pares de fórceps, um par de tesouras, 1 par de tesouras de primavera, um prato de cultura de tecido (10 cm). Previamente borbulhado (mínimo de 15 min) arrefecida (4 ° C) solução de Ringer com 5% CO 2/95% O 2. Preencha 15 cm prato de cultura de tecidos com gelo e cubra-o com placa de metal. Prepare microscópio de dissecção e colocar o pra...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

O método aqui apresentado SC branqueamento é simples, rápido e versátil: (i) permite revelar a morfologia única e SC dinâmica por meio de microscopia confocal baseado num único transgene - o que é uma vantagem significativa quando se combina a abordagem por exemplo, com modelos de doenças que necessitam de alelos adicionais . (Ii) O método é rápido, a partir de dissecação para a fixação pode ser realizada em meio dia. (Iii) O número de aplicações é vasto, uma vez que pode ser combinado com o...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Empresa (exemplo) </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Solução de etanol a 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> em frasco de spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> qualquer outro anestésico aprovado pode ser utilizada para a anestesia letal </td></tr><tr><td> ratinhos transgénicos (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> de ser obtida a partir de fontes citadas </td></tr><tr><td> microscópio de dissecção com iluminação de luz fria </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> equipado com Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> fórceps #2 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> fórceps # 5 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> tesoura, médicos grande </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> tesoura, mola angular pequena </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> na linha de aquecedor </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> aquecimento anel para 3,5 centímetros pratos </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> de dois canais do sistema de controlo de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> sistema de bomba de superfusão </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm de diâmetro prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> cheio de gelo e coberta por uma placa de metal </td></tr><tr><td> 10 centímetros, prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> com solução de Ringer oxigenado do </td></tr><tr><td> 3,5 centímetros, prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> preenchido com polímero Sylgard </td></tr><tr><td> Sylgard polímero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone </td><td></td></tr><tr><td> microscópio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> com laser de árgon </td></tr><tr><td> De 50 ml, tubo de reacção </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA em PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cânula 0,5 mm x 25 milímetros </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> seringa de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpo sinaptofisina </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> coelho </td></tr><tr><td> anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina 0,1 M em PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> lamínulas </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> lâminas </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratórios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> pinos minutien × 10 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-20 </td><td> reduzido para &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α bungarotoxina acoplado a Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solução de Bloqueio </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> O soro de cabra normal a 10% </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% de albumina sérica bovina </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sineiro borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM de NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM de KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM de CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM de MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes específicos e equipamentos. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sequencial de foto-branqueamento fornece uma maneira não-invasiva para rotular SCs individuais no NMJ. O NMJ é a maior sinapse do sistema nervoso de mamíferos e serviu como guia modelo para estudar a estrutura e função sináptica. No rato NMJs terminais do motor axônio formar locais pretzel, como contato com as fibras musculares. O axônio motor e seu terminal são revestidos por SCs. Ao longo das últimas décadas, vários ratinhos transgénicos que foram gerados para visualizar os neurónios motores e SCS, por exemplo Thy1-XFP 1 e Plp-GFP ratos 2, respectivamente. Junto axônios motores, myelinating SCs axonais são dispostos em não sobrepostos entrenós, separados por nós de Ranvier, para permitir a propagação saltatória potencial de ação. Em contraste, a SCS terminais na sinapse são especializados células gliais, que monitoram e promover a neurotransmissão, digerir os detritos e os axônios guia de regeneração. NMJs estão bem cobertos em até meia dúzia de não-mielinating SCs terminais - estes, no entanto, não podem ser resolvidas individualmente por microscopia de luz, uma vez que estão em contacto directo membrana 3. Diversas abordagens existem para visualizar individualmente SCs terminais. Nenhum destes são impecáveis, embora. Por exemplo, o corante de enchimento, em que as células individuais são empalado com um microeléctrodo de corante-cheia, requer a destruição de uma célula marcada antes do enchimento de um segundo. Esta não é compatível com subseqüentes lapso de tempo gravações 3. Multi-espectral &quot;Brainbow&quot; rotulagem de SCs foi conseguido usando a expressão combinatória de proteínas fluorescentes 4. No entanto, esta técnica requer que combina diversos transgenes e está limitado por o padrão de expressão dos promotores utilizados. No futuro, a expressão de &quot;photo-comutável&quot; proteínas em SC pode ser ainda mais 5 alternativa. Aqui apresenta-se foto-branqueamento sequencial, em que as células individuais são branqueados, e sua imagem obtida por subtracção. Acreditamosque esta abordagem - devido à sua facilidade e versatilidade - representa uma adição duradoura para a paleta neurocientista da tecnologia, especialmente no que pode ser utilizado in vivo e transferido para outros tipos de células, os locais anatómicos e espécies 6. No protocolo a seguir, detalhes que a aplicação de branqueamento e seqüencial subseqüente microscopia confocal lapso de tempo para SCs terminais em explantes musculares triangularis Sterni. Esta fina, superficial e facilmente dissecados preparação nervo-músculo 7,8 tem se mostrado útil para estudos de NMJ desenvolvimento, fisiologia e patologia 9. Finalmente, vamos explicar como o músculo Sterni triangularis está preparado para executar após a fixação correlacionada de alta resolução de imagem confocal, imunohistoquímica ou exames ultra-estruturais.

Um exemplo de um explante Sterni triangularis pronto para o prato de imagem é mostrado na Figura 1G. Este explante é particularmente adequada para a imagiologia ex vivo NMJs como o músculo triangularis consiste apenas de algumas camadas de fibras musculares. Isto permite a obtenção de imagens de alta resolução a partir de explantes derivados de linhas de ratinhos transgénicos que realce ou SCs (PLP-GFP 2) e / ou (axónios Thy1-XFP 1). Factores cr?...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. &quot;Sequential foto-branqueamento&quot; permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e<em&gt; Post-hoc</em&gt; Imunomarcações.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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Neurociência

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

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Detecção de<em&gt; In Situ</em&gt; Complexos proteína-proteína no<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

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A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

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