Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a Manuela Budak, Marinkovi Ljiljana y Wullimann Kristina por su excelente asistencia técnica. Damos las gracias a W. Macklin para proporcionar GFP-Plp ratones. TM es apoyado por el Instituto de Estudios Avanzados (Technische Universität München), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB Sonderforschungsbereich 596), por la Alexander-von-Humboldt-Foundation y por la administración nacional (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) en el marco de ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS&quot; y &quot;2-fotón de imagen&quot;. TM y MB son apoyados por el Centro para la Ciencia Proteína Integrado (Munich). PM fue apoyado por la Escuela de Postgrado de la Universidad Técnica de Munich (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1) Tiempo: 15 min. <ol><li> Preparar instrumentos quirúrgicos: 2 pares de pinzas, 1 par de tijeras, 1 par de tijeras de primavera, un plato de cultivo de tejidos (10-cm). Pre-burbujeó (mínimo de 15 min) refrigerado (4 ° C) solución de Ringer con 5% de CO 2/95% O 2. Llena de 15 cm placa de cultivo de tejidos con hielo y se cubre con una placa de metal. Preparar microscopio de disección y colocar el plato 15...

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén - lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Company (ejemplo) </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Etanol 70% (vol / vol) de solución </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en botella de spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> cualquier otro anestésico aprobado puede ser utilizado para la anestesia letal </td></tr><tr><td> ratones transgénicos (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> para obtener de fuentes citadas </td></tr><tr><td> disección con microscopio de luz fría iluminación </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> equipado con Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> fórceps #2 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> fórceps # 5 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, grandes médicos </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> tijeras, primavera ángulo pequeño </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en línea calentador </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> calentar el anillo para los platos de 3,5 cm </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> dos temperaturas canal de control del sistema </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> sistema de bomba de superfusión </td><td></td><td></td><td> hecha a la medida </td></tr><tr><td> 15-cm placa de cultivo de tejidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> lleno de hielo y cubierta por placa de metal </td></tr><tr><td> 10-cm placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> con solución de Ringer oxigenada de </td></tr><tr><td> 3,5 cm de placa de cultivo de tejido </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> lleno de Sylgard polímero </td></tr><tr><td> Sylgard polímero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Elastómero de silicona Kit </td><td></td></tr><tr><td> microscopio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> con láser de argón </td></tr><tr><td> 50-ml tubo de reacción </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PFA al 4% en PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cánula de 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> jeringa de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofisina anticuerpo </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> conejo </td></tr><tr><td> anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M de glicina en PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> cubreobjetos </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositivas </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratorios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien pins × 10 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td><td> acortado a &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxina acoplada a Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% suero normal de cabra </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Campanero burbujeaba con 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP 1 y Plp-GFP ratones 2, respectivamente. A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales - estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana 3. Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo 3. Multiespectral &quot;Brainbow&quot; etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes 4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de &quot;foto-conmutables&quot; proteínas en SC podría ser otra alternativa 5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque - debido a su facilidad y versatilidad - representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies 6. En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación 7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología 9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.

Un ejemplo de un explante triangularis esternón plato listo para formación de imágenes se muestra en la Figura 1G. Este explante es particularmente adecuado para formación de imágenes NMJs ex vivo como el músculo triangularis consiste sólo en unas pocas capas de fibras musculares. Esto permite la obtención de imágenes de alta resolución a partir de explantes derivados de líneas de ratones transgénicos que seleccione ya sea SCS (Plp-GFP 2) y / o axones (Thy1-X...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. &quot;Sequential foto-blanqueamiento&quot; permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

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Neurociencias

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

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Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

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Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

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La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

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¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

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In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

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En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

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Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

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En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...