Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Vi vill tacka Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi och Kristina Wullimann för utmärkt tekniskt stöd. Vi tackar W. Macklin för åstadkommande PLP-GFP möss. TM stöds av Institutet för avancerade studier (Technische Universität München), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), av Alexander-von-Humboldt-stiftelsen och den nationella finansiär (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) inom ramen för ERA-Net NEURON &quot;iPSoALS&quot; och &quot;2-photon imaging&quot;. TM och MB stöds av Centrum för integrerad Protein Science (München). PM stöddes av Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explantation (figur 1) Timing: 15 min. <ol><li> Förbered kirurgiska instrument: 2 par av tång, 1 sax, 1 par våren sax, 1 vävnadsodlingsplatta (10-cm). Pre-bubblades (minimum för 15 minuter) kyld (4 ° C) Ringers lösning med 5% CO 2/95% O 2. Fyll 15-cm skål vävnadskultur med is och täck den med metallplatta. Förbered dissekering mikroskop och placera 15-cm skål med is under dissektion omfattning för att kyla explantat...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

SC blekning metod som presenteras här är enkel, snabb och mångsidig: (i) Det gör att avslöja enda SC morfologi och dynamik genom konfokalmikroskopi baserad på en enda transgen - vilket är en betydande fördel vid kombination av tillvägagångssätt, t.ex. med sjukdomsmodeller som kräver ytterligare alleler . (Ii) Metoden är snabb, från dissekering till fixering kan utföras i en halv dag. (Iii) Antalet ansökningar är bred, eftersom den kan kombineras med andra metoder, såsom cell ablationer, organe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag (exempel) </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> 70% (vol / vol) etanollösning </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> i sprayflaska </td></tr><tr><td> isofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> någon annan godkänd bedövning kan användas för dödlig anestesi </td></tr><tr><td> transgena möss (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> erhålls från nämnda källor </td></tr><tr><td> dissektion mikroskop med kallt ljus belysning </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> utrustad med Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> pincett #2 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.233-20 </td><td></td></tr><tr><td> pincett # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-00 </td><td></td></tr><tr><td> sax, stora medicinska </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.108-09 </td><td></td></tr><tr><td> sax, små vinklade våren </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in-line värmare </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> uppvärmning ring för 3,5-cm skålar </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> tvåkanaligt temperaturregleringssystem </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344b </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion pumpsystem </td><td></td><td></td><td> specialbyggda </td></tr><tr><td> 15-cm vävnadsodlingsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> fylld med is och täckt av metallplatta </td></tr><tr><td> 10-cm vävnadsodlingsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> med syresatt Ringers lösning </td></tr><tr><td> 3,5-cm vävnadsodlingsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> fylld med Sylgard polymeren </td></tr><tr><td> Sylgard polymer </td><td> DOW CORNING </td><td> Sylgard 184 silikonelastomer Kit </td><td></td></tr><tr><td> konfokalmikroskop </td><td> Olympus </td><td> FV1000 </td><td> med argonlaser </td></tr><tr><td> 50-ml reaktionsrör </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA i PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> kanylen 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> spruta 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptofysin antikropp </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> kanin </td></tr><tr><td> sekundär antikropp </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-brunnars platta </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycin i PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> täckglas </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> bilder </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> ^ H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien stift × 10 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-20 </td><td> förkortas till &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin kopplad till Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13.423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blockeringslösning </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% normalt getserum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer bubblades med 95% O 2/5% koldioxid 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCOa 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21.114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgClj 2 </td><td> Sigma </td><td> 63.020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM glukos </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Specifika reagens och utrustning. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sekventiell fotoblekningsreaktion ger en icke-invasiv metod för att märka enskilda kaster på NMJ. Den NMJ är den största synapsen av nervsystemet hos däggdjur och har fungerat som vägledande modell för att studera synaptisk struktur och funktion. I mus NMJs motor axon terminaler bildar kringla-liknande kontakt webbplatser med muskelfibrer. Motorn axon och dess terminal mantlade av SC. Under de senaste decennierna har flera transgena möss genererats att visualisera motoriska nervceller och SCS, till exempel Thy1-XFP 1 och PLP-GFP möss 2, respektive. Längs motor axoner är myeliniserande axonala kaster arrangerade i icke-överlappande internoder, åtskilda av noder av Ranvier att möjliggöra saltatorisk förökning aktionspotential. Däremot terminal kaster i synapsen är specialiserade gliaceller, som övervakar och främjar neurotransmission, smälta skräp och guide regenererande axoner. NMJs är tätt täckt av upp till ett halvdussin icke-LFöPLsprung terminal SCS - dessa kan dock inte vara individuellt lösas genom ljusmikroskop, som de är i direkt membran kontakt 3. Flera tillvägagångssätt existerar för att individuellt visualisera terminala SC. Ingen av dessa är felfri, dock. Till exempel kräver färg fyllning där enskilda celler spetsad med ett färgämne fylld mikroelektrod, förstöra en märkt cell innan du fyller en andra. Detta är inte förenligt med efterföljande tid-lapse inspelning 3. Multispektralt &quot;Brainbow&quot; märkning av SCS har uppnåtts genom att använda kombinatorisk expression av fluorescerande proteiner 4. Emellertid kräver denna teknik att kombinera flera transgener och begränsas av uttrycksmönstret av de använda promotorerna. I framtiden kan uttryck av &quot;foto-omkopplingsbar&quot; proteiner i kaster vara ytterligare ett alternativ 5. Här presenterar vi sekventiell fotoblekningsreaktion där enskilda celler bleks och deras image som erhålls genom subtraktion. Vi troratt detta tillvägagångssätt - på grund av dess lätthet och mångsidighet - representerar en varaktig tillägg till neuroscientist teknik palett, särskilt som det kan användas in vivo och överförs till andra celltyper, anatomiska platser eller arter 6. I följande protokoll, detalj vi tillämpningen av sekventiella blekning och efterföljande konfokal tidsförlopp mikroskopi till plint kaster i triangularis sterni muskel explantat. Denna tunna, ytliga och lätt dissekeras nerv-muskel preparat 7,8 har visat sig användbar för studier av NMJ utveckling, fysiologi och patologi 9. Slutligen förklarar vi hur den triangularis sterni muskeln är beredd efter fixering att utföra korrelerade med hög upplösning konfokal avbildning, immunohistokemi eller ultrastrukturella undersökningar.

Ett exempel på en triangularis sterni explantat redo för avbildning skålen visas i figur 1G. Denna explantat är särskilt lämplig för avbildning NMJs ex vivo som triangularis muskeln består endast av ett fåtal skikt av muskelfibrer. Detta möjliggör erhållande högupplösta bilder från explantat härledda från transgena muslinjer som framhäver antingen SC (PLP-GFP 2) och / eller axoner (Thy1-XFP 1). Kritiska faktorer för hög bildkvalitet ä...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualisera enskilda celler i tätt packade vävnader såsom terminal Schwann celler (SCS) vid neuromuskulär korsningar (NMJs), är en utmaning. &quot;Sekventiell fotoblekningsreaktion&quot; tillåter avgränsar enda terminal SCS, till exempel i triangularis sterni muskel explantation, en bekväm nerv-muskel preparat, där sekventiell blekning kan kombineras med time-lapse avbildning och<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk inspelning av suprathreshold neural aktivitet med encelliga och single-spik upplösning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissekering av Transversus Abdominis muskel för hela berget Neuromuskulär junction analys

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion av<em&gt; In situ</em&gt; Protein-proteinkomplex på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Genöverföring in vivo till Schwann-celler i gnagare ischiasnerven genom elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mäta neuromuskulära förbindelsen funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch inspelningar av Synaptic strömmar från den Drosophila Larval neuromuskulära förbindelsen

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Singel-molekyl spårning i Drosophila presynaptiska Motor nerv terminalen

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...