Name: sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Biz mükemmel teknik yardım için Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi ve Kristina Wullimann teşekkür etmek istiyorum. Biz Plp-GFP fareler sağlamak için W. Macklin ederim. Alexander-von-Humboldt Vakfı tarafından ve ulusal fon ajansı (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; tarafından; TM Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) tarafından İleri Araştırmalar Enstitüsü (Technische Universität München), tarafından desteklenmektedir ) ERA-Net neuron &quot;iPSoALS&quot; ve &quot;2-foton görüntü&quot; çerçevesinde. TM ve MB Entegre Protein Bilim (Münih) Merkezi tarafından desteklenmektedir. PM Technische Universität München (TUM-GS) Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Triangularis sternumun Eksplantasyon (Şekil 1) Zamanlama: 15 dk. <ol><li> Forseps 2 çift, 1 adet makas, makas 1 adet makas, 1 doku kültür kaplarına (10-cm): cerrahi aletler hazırlayın. (15 dakika için asgari) önceden soğutulmuş kabarcıklandırılmış (4 ° C),% 5 CO2 /% 95 O ile 2 arasında Ringer çözeltisi. Buz ile 15-cm doku kültürü çanak doldurun ve metal plaka ile örtün. Diseksiyon mikroskobu hazırlayın ve diseksiyon sır...

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Burada sunulan SC beyazlatma yöntemi, basit, hızlı ve çok yönlüdür: (i) tek bir transgen esas konfokal mikroskopi ile tek SC morfolojisi ve dinamikleri açığa sağlar - Ek allelleri gerektiren hastalık modelleri ile yaklaşım örneğin birleştirerek zaman önemli bir avantaj . Diseksiyon dan tespit için yarım gün içinde gerçekleştirilebilir (ii) &#39;deki metod olup, hızlıdır. Bu tür hücre ablasyon, görüntüleme organeller, elektrofizyoloji veya immünohistokimya gibi başka yöntemler ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirketi (örnek) </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> % 70 (hacim / hacim) etanol </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> sprey şişesinde </td></tr><tr><td> izofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> Başka onaylı anestetik öldürücü anestezi için kullanılabilir </td></tr><tr><td> transgenik fareler (Plp-GFP) </td><td></td><td></td><td> anılan kaynaklardan elde edilecek </td></tr><tr><td> soğuk ışık aydınlatması ile diseksiyon mikroskobu </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> Schott KL 1500 LCD ile donatılmıştır </td></tr><tr><td> forseps #2 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forseps # 5 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> makas, büyük bir tıp </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> makas, küçük açılı bahar </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in-line ısıtıcı </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm yemekleri için halka ısıtma </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> İki kanallı sıcaklık kontrol sistemi </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion pompa sistemi </td><td></td><td></td><td> sipariş üzerine yapılmış </td></tr><tr><td> 15-cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> buz ile dolar ve metal plaka ile kaplı </td></tr><tr><td> 10-cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> Oksijenli Ringer solüsyonu ile </td></tr><tr><td> 3,5 cm doku kültürü çanak </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> Sylgard polimer ile dolu </td></tr><tr><td> Sylgard polimer </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı </td><td></td></tr><tr><td> konfokal mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> FV1000 </td><td> argon laser </td></tr><tr><td> 50 ml reaksiyon tüpü </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS içinde% 4 PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Kanül 0.5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofizin antikor </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> tavşan </td></tr><tr><td> sekonder antikor </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS içinde 0.1 M glisin </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> lamelleri </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> slaytlar </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör laboratuvarları </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien işaretçilerine × 10 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-20 </td><td> &lt;4 mm kısaltılmış </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin Alexa 594 akuple </td><td> Invitrogen (Moleküler Sondalar) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm Engelleme </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> % 0.2 Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Normal Keçi Serum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> % 1 sığır serum albümini </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer % 95 O2 /% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mM KCI </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Özgül reaktifleri ve ekipmanları. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Foto-ağartma Sıralı NMJ tek tek SC&#39;ler etiketlemek için bir non-invaziv bir yol sağlar. NMJ memeli sinir sisteminin büyük sinaps ve sinaptik yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya modeli yol gösterici olarak görev yapmıştır. Fare NMJs Motor akson terminalleri olarak kas lifleri ile simit benzeri iletişim siteleri oluşturur. Motor akson ve terminali SC&#39;ler tarafından kılıflı edilir. Geçtiğimiz on yıl içinde, çok sayıda transgenik farelerin sırasıyla Thy1-XFP 1 ve Plp-GFP fareler 2 örneğin, motor nöronlar ve SC&#39;ler görselleştirmek için üretilmedi. Motor akson boyunca myelinating aksonal SCs sıçrayabilen aksiyon potansiyelinin yayılmasını sağlamak için, Ranvier düğümler yoluyla ayrılmış ve çakışma internod düzenlenmiştir. Buna karşılık, sinaps terminal SC&#39;ler izlemek ve nörotransmisyon teşvik, enkaz ve kılavuz rejenere aksonların sindirmek özelleşmiş glia hücreleri vardır. NMJs sıkıca yarım düzine olmayan myel kadar kapsamındadırTerminal SC&#39;ler inating - onlar doğrudan membran temas 3&#39;te olduğu gibi bu, ancak, ayrı ayrı, ışık mikroskobu ile çözülemez. Çeşitli yaklaşımlar bireysel terminali SC&#39;ler görselleştirmek için var. Bunların hiçbiri olsa, kusursuz vardır. Örneğin, tek hücreler bir boya ile doldurulmuş bir mikroelektrot kazığa olan boya dolgu, ikinci bir doldurma önce bir etiketli hücre tahrip gerektirir. Bu sonraki time-lapse kayıt 3 ile uyumlu değildir. SC&#39;ler Çok-spektral &quot;Brainbow&quot; etiketleme floresan proteinlerinin kombinatoryal ifadesi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Ancak bu teknik, çeşitli transgenlerin bileşiminden oluşur ve ikinci promoterlerin salgılama modeli ile sınırlıdır. Gelecekte, SCs içinde &quot;foto-değiştirilebilir &#39;proteinlerin ekspresyonu daha başka bir alternatif 5 olabilir. Burada ardışık fotoğraf beyazlatma tek hücre ağartılmış, nerede ve çıkarılması ile elde ettikleri görüntüyü sunmak. İnanıyoruzBu yaklaşım - kolaylığı ve çok yönlülük nedeniyle - in vivo kullanılan ve diğerleri hücre tipleri, anatomik siteleri veya türlerin 6 transfer edilebilir özellikle sinirbilimci teknoloji paletine kalıcı yanı, temsil eder. Triangularis sternumun kas eksplantlar terminali SC&#39;ler için ağartma sıralı ve sonraki konfokal time-lapse mikroskopi aşağıdaki protokol, biz detaylı uygulama. Bu, ince yüzeysel ve kolayca diseke sinir-kas hazırlık 7,8 NMJ gelişimi, fizyolojisi ve patolojisi 9 çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Nihayet, biz fiksasyon yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme, immünohistokimya veya ultrastrüktürel incelemeler korelasyon gerçekleştirmek için sonra triangularis sternumun kası nasıl hazırlanır açıklamak.

Görüntüleme yemek için hazır bir triangularis sternumun eksplant bir örneği Şekil 1G &#39;de gösterilmiştir. Triangularis kas kas liflerinin birkaç katmandan oluşur ancak bu gibi eksplant NMJs ex vivo görüntüleme için özellikle uygundur. Bu, transgenik fare hatları elde edilen eksplantlarından yüksek çözünürlükte görüntü elde sağlayan vurgulamak SCs (PLP-GFP 2) ve / veya akson (Thy1 XFP-1) ya da. Yüksek kaliteli görüntülem...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC&#39;ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. &quot;Ardışık fotoğraf beyazlatma&quot; bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC&#39;ler, tasvir verir ve<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...