Name: simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av forskning för att förebygga blindhet och National Institutes of Health bidrag EY10542.

Ett. Retinal Slices Framställning <ol><li> Montera kammaren (utformning illustreras i figur 1). Placera två pärlor av vakuum fett, åtskilda ~ 8-10 mm ifrån varandra, över inspelningen kammaren för att bilda en kanal för superfusate och där att bädda näthinnans skivor. Lägg till en andra sträng av fett några millimeter längre ut bortom var och en av dessa två pärlor av fett för att fungera som en levee och begränsa spridningseffekter. Placera en liten triangulär bit KimWipe i slutet av kammaren för att säkerställa vätskekontakt med referenselektroden. </li><li> Tryck en bit nitrocellulosamembran (~ 5 x 10 mm, 0.8 porer um) platt mot glasmikroskopskiva i två små pärlor av vakuum fett. Undvik att placera fett direkt under centrum av nitrocellulosamembranet, eftersom detta kan förhindra näthinnan från att fastna. </li><li> För att förbereda vävnaden slicer, bryta en dubbel rakblad i 4 bitar och fäst en till skivning armen. Skär en tunn skiva av nitrocellulose membran för att säkerställa att den skärande kanten på rakbladet ligger plant mot inspelningen kammaren och därför skär rent genom nitrocellulosamembranet. </li><li> Håll en liten bägare av amfibie saltlösning (Tabell 1) på isen vid dissektion stationen. </li><li> Euthanize salamander genom halshuggning. Hemisect huvudet sagitally och märg genom ryggmärgen. Placera hälften av huvudet på en bit bomull fuktad med amfibie saltlösning atop en linoleumkvarter. Den andra halvan av huvudet kan lindas med en fuktig pappershandduk och förvarades vid 4 ° C för användning senare under dagen. </li><li> Enucleate ögat. Med små Vannas sax, skära in i huden som förbinder ögat till den omgivande omloppsbana. Efter att frigöra den främre delen av ögat från den omgivande orbital vävnad, dra ögat framåt och skjut saxen under ögat för att skära igenom ögonmusklerna och synnerven, befria ögat från omloppsbana. </li><li> Placera enukleerat öga på en bädd av bomull pålinoleumkvarter. Släng halva huvudet. Trimma överskott orbital fett från baksidan av ögat. </li><li> Gör ett litet snitt i mitten av hornhinnan med en vass kirurgiskt blad. Ta hornhinnan genom att skjuta fina Vannas sax i snittet och utvidga snittet radiellt ut mot ora serrata. Skär omkretsen runt ora serrata genom att rotera linoleumkvarter eller bomull mellan nedskärningar. </li><li> Efter kapning hela vägen runt ögat, ta bort hornhinnan och linsen genom att dra dem ut ur sidan av ögonskålen. Flytta resulterande ögonmusslan på en hård yta av linoleumkvarter fuktad med amfibie saltlösning. Skär den i tredjedelar med ett vasst rakblad, med hjälp av en fin sågning rörelse för att säkerställa att du har klippt hela vägen genom sklera. </li><li> Placera en eller två bitar av ögonmussla på nitrocellulosamembranet med retinal ytan nedåt. Sänk de återstående bitar med extra koksaltlösning och placera dem i kylskåp vid ~ 4 ° C. </li><li> Gently tryck bit ögonskålen mot nitrocellulosamembranet med fin pincett. Sänk nitrocellulosamembranet och ögonmussla bit med flera droppar kall amfibie saltlösning och blot vid kanterna med KimWipe att hjälpa näthinnan att vidhäfta. Återigen, översvämmas ögonmusslan och nitrocellulosamembran med flera droppar kall amfibie saltlösning och skala bort sklera / koroidea / pigmentepitelet att isolera näthinnan (som kan visas rosa på grund av närvaron av oblekt rhodopsin). Vid behov kapa synnerven att frigöra näthinnan. </li><li> Om näthinnan inte har levt tätt, dränera bort saltlösning med en KimWipe att dra näthinnan fastare ner på nitrocellulosamembranet. Byt ut saltlösning. Upprepa om nödvändigt. </li><li> Fylla kammaren med kallt amfibie saltlösning och överföra den till det stadium av vävnaden slicer. Skiva näthinnan och nitrocellulosamembran i tunna strimlor, som arbetar från ena änden till den andra genom att vrida på nonie mikrometeri 125 | im steg. Tryck rakbladet försiktigt men bestämt genom näthinnan och nitrocellulosamembranet. </li><li> Överför näthinnan skivor genom att flytta remsor av nitrocellulosa membran till den främsta kanalen för inspelningen kammaren. Lyft en remsa av membran gratis och sedan hålla den på plats medan du flyttar kammaren under den, var noga med att hålla skivorna nedsänkt. Bädda kanterna på nitrocellulosamembranet i remsorna av vakuum fett, rotera dem 90 grader för att visa de retinala skikten. </li><li> Tryck den platta nitrocellulosamembran mot glasytan. Även om det inte finns näthinnan på varje stycke, placera remsor av nitrocellulosamembran med jämna mellanrum (~ 1 mm från varandra) längs hela längden av perfusionen kanal för att hjälpa till att bryta upp ytspänningen och förbättrar fluidflödet. </li></ol> 2. Kopplade Hel-Inspelningar <ol><li> När allt av skivorna har överförts, flytta inspelningen kammaren till stadiet för en upprätt, faststadium mikroskop och bifoga ledningen referens elektrod. Fokusera på de skivor med hjälp av en lång arbetsavstånd, nedsänkning i vatten, 40-60X objektiv. Mikroskopet bör placeras på en luft bordet för att dämpa vibrationer och inneslutna i en Faradays bur för att minska elektriska störningar. </li><li> Superfuse skivorna kontinuerligt med en hastighet av 1 ml / min med amfibie saltlösning bubblades med 100% O2. Anslut sug, se till att inflödet och utflödet är balanserade. Utflöde kan regleras genom att rotera avfasade änden av sug nål eller genom att flytta KimWipe i slutet av kammaren närmare eller längre bort från avloppsröret nålen. Preparatet kan förvaras i rumstemperatur eller kyls med en Peltier-enhet eller genom att helt enkelt sätta en kylklamp på mikroskop scenen. </li><li> Undersök skivor vid dåliga eller infrarött ljus och identifiera ett par celler - en ljusmätare (stav eller kon) och närliggande horisontell eller bipolär cell - att målet för hela cellen inspelning. Stavar kan vara jagdentified av sina stora cellkroppar och framstående stångliknande yttre segment (Figur 2A). Kottar är mindre än stavar och har små koniska yttre segment. Bipolär cell och horisontella SOMAS cell i yttersta raden av celler organ i det inre nukleära lagret (INL, figurerna 2B och 2C). </li><li> Innan du förbereder skivor, använd en pipett avdragare för att tillverka mikropipetter från borosilikatglas (1,2 mm ytterdiameter, 0,95 mm innerdiameter med ett glas glödtråd). Spetsen av varje mikropipett bör vara ~ 1-2 mikron i diameter. </li><li> Använda en icke-metallisk fyllning nål (t.ex. en tillverkad av en 1 cc spruta eller en Microfil), fyll pipetter med den intracellulära lösningen (tabell 1) och fäst till elektroden hållaren. </li><li> Höj mikroskopobjektivet något. Placera ljusmätare pipett under målet och sedan sänka den så att spetsen är placerad precis ovanför skivorna. Upprepa med than andra pipett. </li><li> Justera eventuell förskjutning i baslinjen nuvarande nivån på förstärkaren. Kontrollera pipetten motståndet med en 5-10 mV depolariserande puls. Vi använder typiskt pipetter som sträcker 10-15 Mohm, resultatet av den långa avsmalningen av axeln och låg osmolaritet av amfibie pipett lösningar. Med högre osmolaritet däggdjurs lösningar, samma pipetter uppvisar resistansvärdena för ~ 8-12 Mohm. Medan vi har använt större spetsdiametrar med resistansvärden 3-4 Mohm i amfibie-lösningar, är de fördelar som en lägre tillgång motstånd kompenseras av ett större svårigheter tätning på cellmembran och en snabbare genomgång av kalcium strömmar och andra andra budbärare -känsliga reaktioner. </li><li> Samtidigt som svagt positivt tryck, läge postsynaptiska pipett så att den får kontakt med horisontella eller bipolär cell kropp. Placera sedan den presynaptiska pipetten så att den kommer i kontakt cellkroppen av en stav eller kotte ljusmätare. Inspelningar Appear vara mer stabila när pipettspetsarna kontakta det inre segmentet snarare än soma, speciellt i koner. </li><li> Under övervakning av resistens, släpp det positiva trycket på postsynaptiska pipett. Ibland är frisättningen av positivt tryck som är tillräckligt för att bilda en gigaohm tätning. Om inte, applicera lätt sugning med en 1 ml spruta eller genom munnen. Efter spetsen motståndet vuxit till&gt; 100 Mohm, tillämpa en anläggning potential -60 mV. Efter att ha fått en gigaohm tätning, null ut eventuella transienter pipett kapacitans och upprepa förseglingsproceduren för fotoreceptorn pipett, applicera en anläggning potential -70 mV. </li><li> Ruptur plåstret genom munnen eller en spruta för att anbringa sug till varje cell i tur och ordning. Stavar, koner och bipolära celler kommer vanligtvis brytning med skonsam sugkraft. Skaffa hel-cell konfiguration med en horisontell cell kan kräva större sug (dvs. med en 3 ml spruta) i kombination med starka snabba spänningspulser levereras med &quot;ZAP&quot; feature av patch clamp-förstärkaren. Bristning av membranet och inrättandet av helcells-konfiguration kommer att vara uppenbart genom uppkomsten av helcell-kapacitans transienter. </li><li> Bekräfta identitet postsynaptiska cellen fysiologiskt genom att tillämpa en ljusblixt och leverera en serie spänning steg från -120 till +40 mV i 20 mV steg (figur 3 och 4). </li><li> För att bedöma om paret av celler synaptically anslutna, leverera en kort (25-100 ms), 60 mV steg depolarisation till ljusmätare (till -10 mV, nära toppen av L-typ spänning-gated kalcium ström) och ser för postsynaptiska strömmar i andra ordningens neuron (Figur 5). En stark depolariserande steg bör framkalla en snabb, övergående inåt postsynaptiska strömmen i postsynaptiska horisontell eller OFF bipolär cell orsakad av en explosion av vesikler utsläpp från konen (Figur 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Ram&#242;n y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Structure of the Retina. , (1972).</li><li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+and+the+retina:+a+100-year+retrospective.">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li><li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina.">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li><li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina.">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina.">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li><li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses.">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li><li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+synaptic+ribbons:+how+they+are+built+and+what+they+do.">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li><li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1:+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li><li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse.">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li><li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).</li><li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation.">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina.">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina:+general+principles+and+species-specific+variations:+the+Friedenwald+lecture.">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li><li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina.">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li><li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors.">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li><li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells:+current+vs.+voltage.">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li><li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors.">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li><li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization.">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li><li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation.">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Den retinal slice preparatet har visat sig mycket användbart för att analysera kretsar och mekanismer som näthinnan att bearbeta visuell information. Möjligheten att erhålla hela cellen inspelningar samtidigt från pre-och postsynaptiska neuron har varit särskilt användbart i denna strävan. Kopplade hela celler inspelningar är mycket lättare att uppnå med skivor än med platt-mount näthinnan preparat eftersom de olika näthinnan lagren utsätts för. Dessutom, på grund av deras stora näthinnans nervceller, salamandrar har en lång historia som en retinal förberedelser och ger därför ett särskilt väldefinierade modellorganismer systemet. Med lite övning kan friska skivor salamander näthinnan framställas regelbundet. Några viktiga steg kan göra skillnaden mellan framgång och misslyckande. 1) Se till att rakbladet är monterad på vävnaden slicer så att den ligger plant mot glasytan och skivor snyggt men både vävnad och underlying nitrocellulosamembran. Om du tagit en rent snitt genom nitrocellulosamembranet, bör du höra ett svagt klickande när rakbladet träffar ytan av ett objektglas. 2) Se till att näthinnan har anslutit sig till nitrocellulosamembranet. Annars kan näthinnan flyta bort från membranet under varje steg av förfarandena. 3) Utsätt inte skurna skivorna till luft, eftersom detta kommer att skada många av de ytliga cellerna. 4) Se till att skivorna och nitrocellulosa membran ligga platt mot glaset bilden så att retinaskikt är uppenbara under dissekera mikroskop. 5) Balansera andelen superfusate inflöde och utflöde för att undvika överfyllda inspelningen kammaren. Detta förhindrar att plötsliga förändringar i lösning nivåer, vilket kan orsaka plötsliga vävnad rörelser. 6) Välj en hälsosam cellpar nära till varandra. Celler med slät cytoplasman är friskare än celler med kornigt cytoplasma. Celler djupare i segmentet är mer benägna att behålla intakt synaptic conkontakter. 7) Kontrollera att pipetten inte har gått sönder eller borstad mot annan vävnad eller skräp på vägen ner till cellerna. 8) Kontrollera pipetten motstånd för att säkerställa att det inte är igensatt med skräp eller en bubbla, som båda kan göra det svårt att erhålla en kvalitet helcells-inspelning. Snarare än att fästa näthinnan till nitrocellulosa filterpapper, bädda in vissa forskare näthinnor i ett block av agar och använda en vibratom att skära retinal skivor. Även om vi inte har provat denna metod, Kim et al. 11 diskuterar fördelarna med båda tillvägagångssätten. I sina erfarenheter, ger den agar synsätt en mer konsekvent utbyte av platta skivor med väl avgränsade retinaskikt men filterpapper synsätt ger friskare fotoreceptorer. Stavar och koner är ansvariga för att omvandla ljus till förändringar i membranpotential. Med parade inspelningar, kan membranet potential stavar eller koner vara manipulpade direkt och så förmågan att generera lätta svar, medan användbart för att identifiera celltyper, kanske inte är nödvändigt. Vi därför ofta förbereda skivor i vitt ljus. Men även om den framställs i starkt ljus, kan salamander näthinnans nervceller genererar stora ljusa reaktioner såsom illustreras av svaren i figur. Tre. Detta beror delvis på en relativt stor reservoar av kromofor i den stora yttre segmentet volym men kan också spegla förmåga Müller-celler för att regenerera 11-cis-retinal för koner 12. För att få fullt mörk-anpassade lätta svar, kan man framställa skivorna under infrarött ljus. För dissektioner under infrarött ljus, fäster vi GenIII Bildförstärkare (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) till okularen i dissektionsmikroskop och belysa vävnaden med en LED infraröd ficklampa. För skärning och andra förfaranden som inte bedrivs under dissekera mikroskop, använder vi en head-mounted imaGE intensifier. För placering av plåstret pipetter, visualisera vi skivor med hjälp av en infraröd-känslig CCD-kamera (t.ex. Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) monterad på den upprätt, fast-stage mikroskop. Med dessa försiktighetsåtgärder, kan man få spö svar uppvisar enda foton känslighet 6, 13. En begränsning av arbetstiden i retinal skivor är att långa cellulära processer av stora fält näthinnans nervceller kan förlora många av sina dendriter under skivning förfarandet. Retinal slice preparat är därför mer användbara för att studera fysiologin hos celler i vilka de synaptiska kontakter involverar processer nära cellkroppen. Amfibie och däggdjur näthinnor delar många av samma celltyper och utnyttja liknande fysiologiska mekanismer 14-16. Medan salamander näthinnan är en bra förebild för många aspekter av däggdjur näthinnan, verkar en viktig skillnad att vara närvaron av en särskild stång väg hos däggdjur som involves kontakter specialiserade stav bipolära celler på AII amakrina celler 14. En ytterligare begränsning av salamander näthinnan är det lilla antal genetiska verktyg som utvecklats speciellt för denna art. Emellertid antikroppar och shRNA reagens som riktar väl konserverade regioner hos andra arter kan användas med framgång i salamander, som kan många små molekylinhibitorer och reagenser peptid. Dessutom, med ett fåtal ändringar i tekniken, kan retinal skivor framställas från andra arter där vissa av dessa verktyg är mer lättillgängliga. Bortom dess användbarhet för parade hel-cell inspelning, är salamandern näthinnan skiva beredning också bli föremål för en mängd andra metoder. Såsom diskuterats ovan, kan retinal skivor kan användas för att studera lätta svar i kombination med olika protokoll spänningsklämma 17. Näthinnans nervceller kan också laddas med fluorescerande färgämnen känsliga för Ca2 +, Cl -, eller Na+ Infördes genom plåstret pipetten eller genom bad-applikation 15,18-20. En fluorescerande peptid som binder till det synaptiska bandet 21 kan införas genom plåstret pipetten och används för avbildning av bandet 10 eller, när den konjugeras till fluorescein, för akut och selektivt skada bandet 22. Vi har också använt retinal skivor i kombination med kvantprickar att övervaka förflyttningar av enskilda kalciumkanaler på tappar och stavar synaptiska terminaler 23. Således är den vertikala retinal slice en mångsidig experimentell förberedelse för att studera grundläggande synaptiska mekanismerna och de unika funktioner bearbetning som utförs vid första synapsen i det visuella signalväg.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

En av de centrala uppgifterna i näthinnan neurovetenskap är att förstå kretsen av näthinnans nervceller och hur dessa anslutningar är ansvariga för utformningen av de signaler som sänds till hjärnan. Fotoner detekteras i näthinnan av tappar och stavar fotoreceptorer, som omvandlar den energin till en elektrisk signal, sänder det till andra näthinnans nervceller, där det bearbetas och kommuniceras till centrala mål i hjärnan via synnerven. Viktiga tidiga insikter i retinal kretsar och visuell bearbetning kom från de histologiska studier av Cajal 1,2 och senare, från elektrofysiologiska inspelningar av tillsatta aktiviteten av näthinneganglieceller - de utgående cellerna i näthinnan 3,4. En detaljerad förståelse av visuell bearbetning i näthinnan kräver en förståelse av signaleringen vid varje steg i banan från ljusmätare till näthinnegangliecell. Men många retinala celltyper är burlivet djupt inne i vävnaden och därför relativt otillgänglig för elektrofysiologiska inspelning. Denna begränsning kan övervinnas genom att arbeta med vertikala skivor, i vilka celler som är bosatta inom varje retinaskikt är klart synlig och åtkomlig för elektrofysiologiska inspelning. Här beskriver vi en metod för att göra vertikala sektioner av näthinnor från larver tiger salamandrar (Ambystoma tigrinum). Även detta preparat utvecklades ursprungligen för inspelningar med skarpa microelectrodes 5,6, beskriver vi en metod för dubbla helcells-inspelningar spänningsklämma från fotoreceptorer och andra ordningens horisontella och bipolära celler där vi manipulerar fotoreceptorn membran potential och samtidigt spelar in post- synaptiska svar i horisontella eller bipolära celler. De fotoreceptorer i tiger salamander är betydligt större än däggdjursarter, vilket gör detta till en idealisk förberedelse på sig att genomföra thans tekniskt utmanande experimentella tillvägagångssätt. Dessa experiment beskrivs med ett öga mot sondera signalering egenskaper hos den synaptiska band - en specialiserad synaptisk struktur som finns i en bara en handfull av nervceller, inklusive stav och kon fotoreceptorer, som är väl lämpade för att upprätthålla en hög tonic neurotransmitterfrisättning 7 , 8 - och hur det bidrar till de unika signalering egenskaper hos denna första retinal synaps.

Representativa spår av lätta svar från nervceller i vertikala skivor av salamander näthinnan visas i figur 3. Könen, horisontella cellen och OFF bipolär cell alla visar en utåtriktad ström som svar på ljus debut. Den framstående inåt ström efter den ljusblixt i horisontell och bipolär cell inspelningar orsakas av ökad frisättning av glutamat från fotoreceptorer som de depolarisera vid offset ljus. Den ON bipolära cellen svarar med en inåtgående ström vid ljus debut följd av en sign-inverterande metabotrop glutamatreceptor signaleringskaskad och aktivering av TRPM1 kanaler 9. Horisontella celler och celler bipolära kan särskiljas från varandra genom deras IV relationer (Figur 4). Horisontella celler har typiskt en linjär eller inåt likriktande IV och låg ingång motstånd (&lt;500 Mohm, Figur 4A) medan bipolära celler har en hög inresistans(0,5-2 GΩ) och utåt-likriktande I - V (Figur 4B) Figur 5 visar representativa resultat från inspelningar av en kon-horisontell cellpar (figur 5A) och kon-OFF bipolär cellpar (figur 5B).. I varje, depolariserande konen till -10 mV från en anläggning potential -70 mV framkallade en spänning-gated kalcium strömmen i könen och snabb inåt EPSC i horisontell eller bipolär cell. Denna starka stimulans är tillräcklig för att tömma lätt öppningsbara pool av ~ 20 blåsor från varje synaptiska band, vilket resulterar i en EPSC av ~ 47 Pa / band 10. Den horisontella cellen EPSC i figur 5A var 232 pA, vilket tyder på att den fått 5 band kontakter från presynaptiska konen. En liknande uppskattning från 178 pA EPSC i off bipolära cellen (Figur 5B) antyder att den fick fyra band kontakter från presynaptiska konen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Amphibian saltlösning </td><td> Presynaptiska pipett </td><td> Postsynaptiska pipett </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamat * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-glukonat ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Tetraetylammoniumklorid </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7,8 </td><td> 7,2 </td><td> 7,2 </td></tr><tr><td> Osmolaritet **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsM </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamat är gjord genom att neutralisera 40 mM L-glutaminsyra med 40 mM CsOH i pipetten lösningen. ** A 1 M förrådslösning av Cs-glukonat görs genom neutralisering av en lösning av CsOH med 45-50% D-glukonsyra. *** PH bör justeras med NaOH för den extracellulära lösningen och CsOH för pipett lösningar. **** Hålla osmolaritet av pipetten lösningar strax under den för den extracellulära lösningen förhindrar cell svullnad och ökar livslängden på inspelningen. BordEtt. Komponenter och parametrar för de vanliga intracellulära och extracellulära lösningar som används i detta protokoll. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figur 1. Inspelning kammare design. (AC) Topp, sida, och utskurna vyer av inspelningen kammaren visar dimensioner. Kammaren är bearbetat ur ett 2 mm tjockt stycke av akryl.. (D) sammansatta kammare Superfusate kommer in i kammaren genom ett 10 cm långt rör av Teflon (inloppsröret, typ 24LW). Superfusate avlägsnas genom att applicera mild sugning till en avfasad 20 gauge metallröret på den andra sidan av kammaren. Intill denna utgång röret är en Ag / AgCl pellet referens elektrod. Ledningen från denna referens elektrod är ansluten till referensingången på headstage. En liten triangel av KimWipeplaceras över referenselektroden att hålla den i kontakt med lösningen och reglera vätskeflödet in i slutstycket. Den undre delen av kammaren är bildad genom att placera ett objektglas mikroskop i de insänkta kanterna av kammaren. Sliden hålls på plats med en sick av vakuum fett. Remsor av nitrocellulosamembran med retinal skivor är inbäddade i pärlor av vakuum fett som bildar en kanal för lösning att flöda. Innan du köper skivor, är en 5 x 10 mm bit av nitrocellulosa membran anbringas på kammaren med två små pärlor av vakuum fett. En bit av ögonskålen placeras vitreal nedåt på denna nitrocellulosa membran och lyftas bort när näthinnan fastnar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figur 2. Dye-fyllda cellpar i vertical skiva beredning. A) Bilder av en stav och synaptically-kopplade horisontellt cell som fylldes med kontrasterande fluorescerande färgämnen som införts via plåstret pipetten under samtidig helcells-inspelning. Lucifer gul (2 mg / ml) ingick i staven pipetten lösningen (gul) och sulfarhodamine B (1 mg / ml) ingick i den horisontella cellen pipett lösning (lila). Fluorescerande bilder fångades med hjälp av en snurrande skiva konfokalmikroskop (Perkin Elmer Ultraview LCI) utrustad med en kyld CCD-kamera (Orca ER) och monterad på den fast scen mikroskop (Nikon E600 FN med 60X, 1,0 NA nedsänkning i vatten mål). Dessa bilder överlagras på ljusfält bilder av motsvarande retinala skivor med hjälp av Adobe Photoshop. B) Bilder av en kon och synaptically-kopplade OFF bipolär cell. Den bipolära cellen axon terminal ramifies i den yttersta (S1) sublamina den inre plexiformskiktet nära gränsen med det inre nukleära lagret. <strong&gt; C) Bilder av en kon och synaptically-kopplade horisontella cellen. Observera att de koniska terminalerna är betydligt större än axonet terminalen av staven. Även horisontella celler kan identifieras genom den avlånga formen på sin cell kroppar, cellkroppar av ON-och OFF-typ bipolära celler i INL inte kan särskiljas lätt före inspelningen. Dock kan ett mål förskjutas kon-driven OFF bipolära celler som har cellkroppar i ONL och som kan särskiljas från kottar genom frånvaron av inre och yttre segmenten. Skalan bar är 20 mikrometer. <img alt="Figur 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figur 3. Ljus-framkallade strömmar spelats in under spänningsklämma från fyra olika näthinnans nervceller som svar på en ljus 500 ms blixt av vitt ljus. Könen (A), horisontell cell <strong&gt; (B), och av bipolär cell (C) alla svarade att lysa med en utåtgående ström. (D) Den på bipolära cellen svarade på samma Ijusstimulus med en aktiv ström. Baslinjen buller uppvisas av off bipolära cellen (C) speglar en kontinuerlig frisättning av synaptiska vesiklar i mörker som minskar när fotoreceptorer hyperpolarisera i ljuset. Svaren från dessa fyra celler erhölls i separata inspelningar med skivor framställda under vitt ljus. Intensiteten av det vita ljuset stimulus som används i dessa exempel producerade svar i horisontella och bipolära celler motsvarande 580 nm fotonflödet av 1 x 10 5 fotoner / sek / ìm 2. <img alt="Figur 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figur 4. Ström-spänning (IV) relationer hVERGRIPANDE och av bipolära celler. (A) Top panel, membran strömmar framkallade av en serie av 150 ms spänningssteg från -120 till 40 mV tillämpas i 20 mV steg (nedre panelen) till en horisontell cell. Horisontella celler har typiskt en låg ingångsresistans och linjära eller inåt likriktande IV relationer. (B) IV relation av en off bipolär cell som svar på en serie av spänningssteg. Bipolära celler har en högre ingångsresistans och en utåt likriktande IV, då aktiveringen av spänningskänsliga kaliumströmmar. <img alt="Figur 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figur 5. Exempel på parade inspelning uppgifter. (A) Inspelning av konspänningen-gated kalcium ström (Cone I Ca </sub&gt;) som svar på en 100 msek steg till -10 mV från en hållpotential av -70 mV (Cone V m). Läckage och kapacitans transienter var subtraheras med ett P / 8 läcka subtraktion protokollet. En snabb excitatoriska postsynaptiska ström (EPSC, HC PSC) spelades in samtidigt från en horisontell cell, som visar att dessa två celler synaptically kopplas (B) En EPSC spelades in i en off bipolär cell som svar på samma stimulus i en annan. kon.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation at JoVE.com

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Vi beskriver framställningen av tunna retinal skivor från vattenlevande tiger salamandrar (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Och förklara hur vi använder dessa skivor för att studera synaptisk bearbetning i näthinnan genom att erhålla dubbla hel-cell inspelningar spänningsklämma från fotoreceptorer och andra ordningens horisontella och bipolära celler.

Samtidiga Hel-Inspelningar från fotoreceptorer och andra ordningens neuron i ett Amfibie näthinnan Slice Förberedelser

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

En isolerad näthinnan förberedelse till Record Ljus Svar från Genetiskt Märkta Retinal ganglion celler

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Inspelning Ljus framkallade Postsynaptiska svar i nervceller i Dark-anpassade, mus näthinnan Slice Förberedelser Använda Patch Clamp Tekniker

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metod för inspelning Intracellulärt Spännings svar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer och Intern på ljusstimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...