Name: processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

MAL, JCG, og MRS støttes af NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og Laboratory Directed Forskning og Udvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.

1. Vævsbehandling og fordøjelse <ol><li> Opnå humant brystvæv som skille materiale fra kirurgiske procedurer. Reduktion mammoplasties kan tilvejebringe normale eller benigne celler, fibroadenomas og gynecomastias giver godartede celler, ikke-tumor mastektomi væv (perifer eller kontralateral til en tumor eller subkutan) tilvejebringelse af celler, der kan variere fra normal til godartede til indeholdende microtumors. Sikre ordentlig IRB godkendelse eksisterer forud for opnåelse af affald. Alt materiale skal behandles i henhold blodbårne patogener regler. </li><li> Anbring materialet i sterile beholdere indeholdende puffer eller medier (f.eks 1:1 Dulbeccos modificerede Eagles medium og Hams F-12) suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 5 ug / ml Fungizone, 50U/ml polymyxin B, og 10% kalvefosterserum, og transport til laboratoriet ved 4 ° C. Reduktion mammoplasty væv kan opbevares eller forsendes ved 4 ° C i 72 timer uden signifikant at påvirke subsequent cellelevedygtighed. Små stykker af ikke-reduktion mammoplasty væv kan kræve mere hurtig behandling. </li><li> Adskil de epiteliale områder fra det stromale matrix af fedtvæv, bindevæv og blodkar under anvendelse af en kombination af steril skalpel, pincet og saks. Klip stykker af væv med saks og anbringes i et stort glas steril fad (f.eks 150 mm). Forsigtigt dissekere de epiteliale områder, der vises som hvide tråde indlejret i yellower stromal matrix under anvendelse af pincet til at holde materialet og skalpel at skrabe væk groft fedtstof. For at lette fordøjelsen, skære epithelvæv i mindre stykker ~ 3-4 mm ved hjælp af modsatrettede skalpeller og anbringes i et 50 ml reagensglas. Hvis store mængder væv bliver behandlet, kan friske skalpelblade være behov. Fjern fedt materiale fra fadet til bortskaffelse i henhold til de institutionelle regler. <ol class="lalpha"><li> I stærkt fibrøse væv (f.eks subkutane mastectomies med svær fibrocystisk sygdom), vil der være mere fast hvidt, ikke-epithelial materiale. Det kan være vanskeligt at dissekere de epiteliale celler fra sådanne fibrøse matrixer. Store stykker af fibermateriale kan skæres i mindre stykker, der er ~ 1-3 mm firkant i område og spaltet separat. </li></ol></li><li> Anbring det dissekerede epithelvæv i et konisk centrifugerør (50 ml eller 15 ml) med væv omfattende ikke er større end en tredjedel af volumenet af røret. Bringe røret op til fuld volumen, så kun en lille luftrum at tillade blanding under rotation, ved anvendelse af en vævs-spaltningsblanding (DME/F-12 eller tilsvarende, 10 ug / ml insulin, antibiotika som ovenfor, og slutkoncentration på 10 % FCS, 200 U / ml rå collagenase og 100 U / ml hyaluronidase. </li><li> Rørene anbringes på et HulaMixer rør rotator og dreje 360 ​​° ved 8 rpm natten over ved 37 ° C. </li><li> Centrifuger rørene ved 600 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, fedt og medium til bortskaffelse overenskomstING til institutionelle regler. </li><li> Tjekke for færdiggørelse af spaltning ved at fortynde en lille prøve af pelleten i medium. Fordøjelsen er fuldstændig, når mikroskopisk undersøgelse viser klumper af celler (organoids) med glat vises duktale, alveolær eller ductal-alveolære strukturer fri vedlagte stroma (figur 1A). Reduktion mammoplasty væv vil normalt stadig vise vedhæftede stroma efter en overnatning fordøjelse og vil kræve yderligere fordøjelse tid. <ol class="lalpha"><li> Resuspender ufuldstændigt fordøjet pellet i frisk væv spaltningsblanding og re-inkuberes med rotation ved 37 ° C i yderligere 4-12 timer. Gentag trin 1,6 og 1,7. Hvis fordøjelsen er stadig ufuldstændig, igen tilføje spaltningsblanding til pelleten og igen inkuberes med rotation ved 37 ° C natten over. Koncentrationen af ​​enzymer kan reduceres for at undgå over-fordøjelse natten over. </li></ol></li><li> Når fordøjelsen er fuldstændig, centrifugeres rørene ved 600 xg i 5 minutter, opsug fordøjedeion mix, Resuspender pellet i medium plus antibiotika ved cirka 15 ml/50 ml rør, 5 ml/15 ml rør. </li></ol> 2. Filtrering og Nedfrysning af fordøjede materiale <ol><li> Overfør alikvoter af den resuspenderede pellet til en steril 100 um si i et sterilt 50 ml rør. Lad mediet afløb ind i røret, så rewash de organoids på toppen 1-2x gange med 2-3 ml medium. Gentag, indtil alle den resuspenderede pellet er blevet overført. Hvis der er for mange organoids på filteret, og mediet ikke længere afløb let, bruge et nyt filter (s) for det resterende materiale. Omhyggeligt vende filter (s) oven på et andet sterilt rør og vaske organoids ind i røret med større medium. Dette er den 100 pm organoid pool. </li><li> Tage materiale, der drænes ind i den oprindelige 50 ml rør og gentage processen på 2,1 under anvendelse af en 40 um si, til opnåelse af 40 um organoid pool, som indeholder det meste bicellestrukturer. Det materiale, der drænes ind the rør udgør filtratet pool, der indeholder enkelt-/ små klumper af mesenchymal-og epitelceller og små stykker af karrene. </li><li> Pelletere 100 um, 40 um, og filtrat puljer ved 600 x g i 5 min. </li><li> Aspirer supernatanten Rekonstituer hvert rør i CPM II (DME/F-12 eller tilsvarende med 44% FCS og 6% DMSO) med ca 1 ml CPMII per 0,1 ml pakkede pellet. Opbevares ved 4 ° C. </li><li> Seed en test skål for de 2 organoid pools ved at placere 0,1 ml resuspenderet materiale ind i en 35 mm vævsdyrkningsplastic fad dråbe for dråbe som i 3,2 nedenfor. Filtratet Puljen kan direkte podes på vævsdyrkningsplast med fibroblast-medium (DME/F-12 eller tilsvarende med 10 ug / ml insulin og 10% FBS). </li><li> Alikvot det resterende resuspenderede materiale i Nunc typen frysning ampuller (1 ml / 2 ml ampul). Frys natten over ved -80 ° C og derefter overføre hurtigt til opbevaring i flydende nitrogen. Vi har ikke observeret noget betydeligt tab af levedygtighedi vores oprindelige ampuller opbevares frossen siden slutningen af ​​1970. </li></ol> 3. Såning Frosne Organoids og subkultur af primære kulturer <ol><li> Hurtigt optø den frosne ampul indeholdende de organoids i et 37 ° C vandbad. Seed de organoids i 2-10 (sædvanligvis ~ 6) 60 mm skåle eller 1-3 100 mm skåle, afhængig af visuel vurdering af antallet af organoids i ampullen. Ca. 20-40 organoids podet pr 60 mm skål er optimal. </li><li> Optøede organoids er omhyggeligt placeret, dråbe for dråbe, på skålen overflade med en 1 ml pipette eller Pasteur-pipette til en jævn fordeling af organoids. Organoids placeret tæt sammen har begrænset plads til udvækst, giver anledning til færre celler til subkultur eller frysning. Undgå at ridse skålen overflade (celler tendens til ikke at vokse tidligere ridsede overflader). Vent 1-2 min for at tillade organoids at vedhæfte og derefter langsomt tilføje vækstmedium for at undgå dislodging de organoids (fx 2-3 ml/60 mm skål). Jegncubate ved 37 ° C i befugtet CO2-inkubator. Disse er de primære kulturer. Vi anvender i øjeblikket M87A + oxytocin (X) medium for den mest robuste HMEC vækst (figur 2). </li><li> Efter 1 dag, skal du kontrollere, at de organoids er vedlagt. Tilføj yderligere medium (fx 2-3 ml/60 mm skål). Cellemigrering fra organoids bør være synlige ved 24-48 timer og mitotisk udvækst af 48-72 timer efter podning (figur 1B, C). Sommetider vedhæftet fil er dårlig, efter 24 timer, især hvis udpladning overdigested organoids eller organoids fra ældre kvinder, men de fleste præparater vil vedhæfte indenfor 72 timer. Små stykker af vaskulaturen kan vedhæfte og give anledning til fibroblastcellelinje udvækst (figur 1D). </li><li> Foder kulturer mindst 3 gange om ugen. Celler dyrket i M87A-medietype vokse til nær konfluens i 5-8 dage, afhængig af densiteten af ​​podning. </li><li> Hvis der er betydelig fibroblastvækstfaktor, Differential trypsinisering (DT), baseret på denhurtig løsgørelse af fibroblaster fra overfladen plast, er nødvendig for at fjerne fibroblaster. Når de epiteliale patches bliver store, aspireres medierne, vask skålen (eksempelvis 1-2 ml/60 mm skål) med STE (saltvand, 0,05% trypsin, 0,02% EDTA), aspirat, tilsættes frisk 0,5 ml STE og henstår ved stuetemperatur for omkring 1 min med kontinuerlig mikroskopisk observation. Når fibroblasterne løsnes, men epitelcellerne stadig er klæbende, let men stærkt banke på siden af ​​skålen mod en hård overflade til at løsne fibroblasterne og derefter hurtigt sug. Vask en gang med PBS, og der opsuges igen. Kulturer stærkt forurenede med fibroblaster kan have brug for en ekstra DT. </li><li> Subkultur primære kulturer, hvor store epiteliale patches er til stede, men før sammenløb. Densiteten af ​​organoid podning og fastgørelse vil påvirke den nødvendige tid. For at fastholde den primære kultur og til at generere flere sekundære kulturer, fordelt over tid, vi udfører Delvise Trypsinizations (PT). </li><li> Aspirer medier, vaske en 60 mm skål med 1-2 ml STE, tilsættes 0,5 ml frisk STE til parabol. Observere celle løsgørelse under mikroskopet ved stuetemperatur i 1-5 min, under forsigtig bankede af skålen til at fremme celle-adskillelse. Trypsinisering skal stoppes, når ~ 50% af cellerne er frigjort. Tidlig PT har normalt en hurtig celle detachement. For senere PTS, kan cellerne placeres ved 37 ° C for hurtigere detachement, med omhyggelig monitorering, da alle cellerne kan komme ud hurtigt. </li><li> Tilsæt 2 ml serum-holdige medier til skålen, til repipette vaske og overføre til et sterilt 15 ml rør. Gentag 2x med en anden ~ 1-2 ml medier, tilsætning af vask til røret. Refeed den primære skålen og vende tilbage til inkubatoren. Tæl cellerne i røret med hæmocytometer. PT&#39;er kan gentages ca 4-8 gange med god celle genvækst i de primære retter og tilsvarende langsigtet vækst fra de subkultiveres eller frosne sekundærviklinger (anden passage celler kaldes secondaries, når videredyrket, celler ikke longer primærvalg). Når organoid materiale ikke længere er til stede i de primære kulturer, videredyrkes secondaries viser et fald i langsigtet befolkning fordobling potentiale. </li><li><ol class="lalpha"><li> For subkultur til secondaries, frø celler direkte fra røret ind retter. Podning på 1-2 x 10 5 celler/100 mm skål i et robust medium, såsom M87A + X vil føre til konfluens i 4-7 dage. Vi tilsætter koleratoksin til mediet i den anden passage til at øge proliferativt potentiale, choleratoxin er udeladt i primær kultur, fordi den fører til flerlaget celleudgroning fra organoids. </li><li> Til frysning som secondaries,. Pellet rør ved 600 x g i 5 minutter, og resuspender i CPMII med en endelig massefylde på 10 6 celler / ml Portion resuspenderes cellerne i Nunc typen frysning ampuller, fryses natten over ved -80 ° C og derefter overføre hurtigt til opbevaring i flydende nitrogen. </li></ol></li><li> Det anbefales at fryse cellerne fra den første PT til opbevaring, oganvende celler fra den anden PT for subkultur. Yderligere PT&#39;er kan opbevares frosset til senere brug. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Den humane brystvæv forarbejdningsmetode præsenteres her muliggør opnåelse af rene mammae epitelceller fra den heterogene blanding af celletyper i det humane bryst. Filtrering gennem porer med fast størrelse tillader adskillelse af forskellige fraktioner af mælkekirtlen (f.eks ductal og ductal-alveolar vs alveolar) fra det fordøjede stromal matrix. Isogene mamma fibroblaster kan fås til at matche epitelcellerne. Frozen fordøjet materiale har bevaret god rentabilitet i over 30 år. Denne metode har fungeret succesfuldt på alle men meget fibrøse mammae væv, og er enkel at udføre. Andre variationer af brystvæv behandling findes, der ikke giver epiteliale fraktioner, der er så levedygtige, ren eller separeret. Placering af forarbejdede organoids i kultur med lave stress-fremkaldende medier, såsom M87A tillader langsigtet vækst i HMEC med flere afstamning markører. HMEC som er blevet dyrket på plast stadig bevarer evnen til at slægterte 3D strukturer med normal in vivo-lignende afstamningsceller relationer. Disse HMEC kulturer er velegnede til omfattende eksperimentel undersøgelse, herunder high throughput, af normal HMEC adfærd og faktorer, der kan fremdrive eller hæmme ældning og transformation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glas Petriskål 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Saks 6,5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Tang 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Skalpeller engangs </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B-sulfat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Trypsin 0.05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Cell filter 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352.360 </td></tr><tr><td> Cell si 40 pm </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td></tr><tr><td> Rør 15 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Rør 50 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC skåle 10 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC retter 6 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Cryorør </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Eppendorf model </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Eksperimentel undersøgelse af normal human mammae epitelceller (HMEC) adfærd, og hvor normale celler erhverver abnorme egenskaber, der kan lettes ved in vitro-dyrkningssystemer, der mere præcist model in vivo biologi. Anvendelsen af humant afledte materiale til undersøgelse af cellulær differentiering, aldring, ældning og immortalisering er særlig fordelagtig i betragtning af de mange vigtige molekylære forskelle mellem disse egenskaber mellem humane og almindeligt anvendte gnaverceller 1-2. Mammae celler udgør en bekvem model system, fordi store mængder af normale og unormale væv er tilgængelige på grund af hyppigheden af ​​reduktion mammoplasty og mastektomi kirurgi. Mælkekirtlen består af en kompleks blanding af mange forskellige celletyper, fx epitel-, fedt-, mesenchymal, endotel. Epitelcellerne er ansvarlige for differentierede mammary funktion af laktation,og er også oprindelsen af ​​størstedelen af ​​humane brystcancere. Vi har udviklet metoder til at behandle brystkirtel kirurgiske udsmid væv til rene epithelceller komponenter såvel som mesenchymale celler 3. Det bearbejdede materiale kan opbevares frosset på ubestemt tid, eller initieret i primær kultur. Kirurgisk skille materialet transporteres til laboratoriet og manuelt dissekeret for at berige for epitel-indeholdende væv. Efterfølgende fordøjelse af det dissekerede væv med collagenase og hyaluronidase strimler stromal materiale fra epitelet ved basalmembranen. De resulterende små stykker af epitel træet (organoids) kan adskilles fra det fordøjede stroma ved sekventiel filtrering på membraner af faste porestørrelse. Afhængig af porestørrelsen, kan fraktioner opnås der består af større duktale / alveolære stykker, mindre alveolære klynger, eller stromale celler. Vi har observeret overlegen vækst, når kulturer indledt som organoids snarere end som disknyttede enkeltceller. Placering af organoids i kultur ved hjælp af lav-stress inducerende medier understøtter en langsigtet vækst i normal HMEC med markører for flere afstamning typer (myoepithelial, luminal, stamfader) 4-5. Et tilstrækkeligt antal celler kan opnås fra et individs væv for at tillade omfattende eksperimentel undersøgelse ved hjælp af standardiserede celle batches samt interrogationssignaler med højt gennemløb modaliteter. Cultured HMEC har været ansat i en lang række undersøgelser af de normale processer, der styrer vækst, differentiering, aldring og alderdom, og hvordan disse normale processer ændres under det udødelige og malign transformation 4-15,16. Virkningerne af vækst i nærvær af ekstracellulært matrixmateriale, andre celletyper, og / eller 3D-kultur kan sammenlignes med vækst på plast 5,15. Cultured HMEC, startende med normale celler, give et eksperimentelt medgørlig-system til at undersøge faktorer, derkan fremdrive eller forhindre menneskers aldring og carcinogenese.

Repræsentative tal for væv hensigtsmæssigt fordøjede til organoids og anbragt i kultur er vist i fig. 1. Ufuldstændigt nedbrudt væv viser materialet stadig er knyttet til ydersiden af ​​disse strukturer, og vil sandsynligvis have nogle fibroblastisk cellevækst i primær kultur, hvilket kræver DT at fjerne. Overdigested væv vil vise mindre glatte ydre grænser, og kan tage længere tid at vedhæfte i primær kultur. Epithelial udvækst bør begynde inden for 48-72 timer (1B, C). Små stykker af vaskulatur (1D) kan være en kilde af mesenchymal celleudgroning. Epiteliale udvækster viser morfologisk heterogene populationer, med proliferative populationer, der indeholder blandinger af celler med markører forbundet med myoepithelial, progenitor og luminale afstamninger (1E, 3C-E). Vækst i lav belastning medier såsom M87A suppleret med koleratoksin og oxytocin vil støtte overlegen lang sigtvækst af normale præ-stase HMEC forhold til tidligere medieformuleringer (figur 2). M87A-type medier vil også understøtte væksten af luminale og stamceller gennem passager 4-8 (fig. 3C-E, 4), derefter, de fleste celler viser kun myoepithelial afstamning markører. HMEC dyrket på plast kan bevare deres evne til at danne en korrekt 3D selvorganisering micropatterned 3D mikrobrønde med luminale celler indvendige til myoepitelcellerne (figur 4A, B), og til dannelse af organiserede strukturer, når udpladet i Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. HMEC organoids og primær kultur. (A) Organoid viser ductal-alveolære struktur efter fordøjelse og filtrering. (B, C) Organoids viser ductal og alveolære struktur 2 dage efter anbringelse i primær kultur, notere starten cell outgrowth (hvide pile). (D) Lille blodkar fastgjort og med udgangspunkt fibroblast udvækst fra samme kulturer som B, C. (E) Epithelial celleudgroning fra primær organoid kultur efter 4 dage. Slægter identificeres ved farvning med antistoffer mod K14 (rød) og K19 (grøn), kerner blev farvet med DAPI (blå). Luminale (K14-/K19 +, grøn), myoepithelial (K14 + / K19-, rød), og stamfader (K14 + / K19 +, gul) celler er synlige. Ufarvede celler i den organoid kerne på grund af ufuldstændig antistof penetration. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Vækst af HMEC kulturer i forskellige medier formuleringer. Organoids opnået fra et individ, prøve 184, blev påbegyndt i primær kultur ved hjælp af forskellige medier formuleringer. Bedste langsigtet vækst opnås ved hjælp af vores seneste formulering, M87A + oxytocin (X) 4. Dette medium understøtter ogsåvækst af flere HMEC linier (se fig. 1E). En tidligere medier formulering, MM 3 tilvejebragt mindre robust vækst, mens en serum-frie medier, MCDB170 (kommerciel MEGM) 17 fører til hurtig induktion af cyclin kinaseinhibitor P16 INK4A og selektion for afvigende celler 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figur 3. Sammenligning af afstamning mangfoldighed i ukultiverede organoids og dyrkes HMEC ved 4 th passage. (A, B) FACS-analyse af en ukultiveret, enzymatisk dissocierede organoid for (A) ekspression af EpCAM og CD49f/alpha 6 integrin, og (B) CD227/Muc1 og CD10/CALLA. (C, D) FACS-analyse af 4. passage pre-stase HMEC til ekspression af (C) EpCAM og CD49f/alpha 6 integrin, og (D) CD227/Muc1 og CD10/CALLA. Identificerbare populations er mærket som LEP (udtrykker luminal markører EpCAM eller CD227), MEP (udtrykker myoepithelial markører CD49f eller CD10) eller PROG (beriget i CD49f + / EpCAM + befolkning). Bemærk, at der under tilpasning til kultur regulering af EpCAM og CD49f ændringer i forhold til ukultiverede organoids. (E) Unsorted HMEC og FACS-beriget LEP og MEP på 4 th passage farvet for immunfluorescens analyse af keratin K14 (MEP markør) og K19 (LEP markør) for at kontrollere afstamning identifikation. Nuclei farvet med DAPI er blå. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figur 4. Cultured HMEC kan danne organiserede strukturer med in vivo-lignende slægt relationer, når de placeres i passende mikromiljøer. (A) Pre-stasis 4 th passage HMEC var FACS-beriget into luminale LEP og myoepithelial MEP afstamninger med markører for CD227 og CD10, med disse slægter verificeret ved ekspression af K14 og K19 (ikke vist). (B) Når blandet sammen i micropatterned mikrobrønde, de dyrkede celler var i stand til selvorganisering i dobbeltlag med MEP på ydersiden og LEP indre [tilpasset fra Chanson et al. 5]. Fluorescensmærket LEP (grøn) og MEP (rød) blev afbildet med et konfokalt mikroskop ved 0 timer, 24 timer og 48 timer efter tilsætning til mikrobrønde (øvre). Kontrol HMEC blev vilkårligt mærket med røde eller grønne fluorescerende mærker (lavere). (C) Lyse field billede af FACS-berigede stamceller (cKit +) udpladet i 3D (Matrigel) kultur og dyrket i 18 dage. Resulterende strukturer kan udvise alveolær morfogenese. (D) Konstruktioner blev ekstraheret fra Matrigel og farvet til påvisning af K14 og K19, kerner blev modfarvet med DAPI. Immunofluorescent analyse viser organiserede strukturer med korrekt luminale og basal polahed.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

En fremgangsmåde til at behandle human mammae kirurgisk skille materiale beskrives. Behandlet væv, i form af organoids, kan opbevares frosset ubestemt tid eller anbringes i kultur i langsigtet vækst. Denne metode giver mulighed eksperimentel undersøgelse af normal human epitel cellebiologi, og virkningerne af udefra kommende forstyrrelser.

Behandling af human Reduction mammoplasty og mastektomi væv til celledyrkning

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling af primær hjernetumor Tissue for stamcelle Analyser og Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolation, Kultur og Imaging for Human Føtal pankreascelle Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Humant Dupuytrens<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur for Studiet af myofibroblaster og ekstracellulære matrix-interaktioner

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Dannelse Assay fra human brystkræft væv og cellelinier

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbejde med Humane væv til Translationel kræftforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivekulturmodel til undersøgelse af tumorcellemigration og patientspecifikke virkninger af antiinvasive stoffer

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tre-dimensionel Alginat-perle dyrkning af humane hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...