Name: processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

MAL, JCG, og MRS er støttet av NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og ved Laboratory rettet forskning og utvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.

1. Tissue Processing og fordøyelse <ol><li> Skaffe menneskelig mammary vev som kast materiale fra kirurgiske prosedyrer. Reduksjon mammoplasties kan gi normale eller godartet celler, fibroadenomas og gynecomastias gi godartede celler, ikke-tumor mastektomi vev (perifer eller kontralateral til en svulst, eller subkutant) gir cellene som kan variere fra normal til godartet til inneholder microtumors. Sikre riktig IRB godkjenning foreligger før skaffe forkaste materiale. Alt materiale skal behandles under bloodborne patogen forskrifter. </li><li> Plass materiale i sterile beholdere som inneholder buffer eller mediet (f.eks 01:01 Dulbeccos modifiserte Eagles medium og Hams F-12) supplert med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 5 ug / ml Fungizone, 50U/ml polymyxin B, og 10% føtalt bovint serum, og transport til laboratoriet ved 4 ° C. Reduksjon mammoplasty vev kan lagres eller sendes ved 4 ° C i 72 timer uten vesentlig påvirker subsequent celleviabilitet. Små deler av ikke-reduksjon mammoplasty vev kan kreve mer rask behandling. </li><li> Skille epiteliale områder fra stromal matrise av fettvev, bindevev og blodkar ved hjelp av en kombinasjon av steril skalpell, tang og saks. Skjær biter av vev med saks og legg i et stort glass sterilt parabolen (f.eks 150 mm). Forsiktig dissekere ut epiteliale områder, som vises som hvite tråder innebygd i gulere stromal matrise, ved hjelp av pinsett til å holde materialet og skalpell for å skrape bort grovt fatty materiale. For å lette fordøyelsen, kutt epitelvev i mindre biter av ~ 3-4 mm ved hjelp motsatte skalpeller og sted inn i en 50 ml reagensrør. Hvis store mengder vev blir behandlet, kan ferske skalpell blad være nødvendig. Fjern fatty materiale fra parabolen for deponering i henhold til institusjonelle bestemmelser. <ol class="lalpha"><li> I tungt fibrøs vev (f.eks, subkutane mastectomies med alvorlig fibrocystic sykdom), vil det være mer solid hvit, ikke-epiteliale materiale. Det kan være vanskelig å dissekere ut epitelcellene fra slike fibrøse matriser. Store deler av fibermateriale kan kuttes i mindre biter som er ~ 1-3 mm torget i området og fordøyd separat. </li></ol></li><li> Plasser den dissekerte epitelvev i en konisk sentrifugerør (50 ml eller 15 ml) med vevet omfattende ikke større enn en tredjedel av volumet av røret. Bring røret opp til hele volumet, slik at bare en liten luft plass for å tillate blanding under rotasjon ved hjelp av en vev fordøyelsen blanding (DME/F-12 eller tilsvarende, 10 ug / ml insulin, antibiotika som ovenfor, og endelig konsentrasjon på 10 % FCS, 200 U / ml råolje kollagenase og 100 U / ml hyaluronidase. </li><li> Sted rør på en HulaMixer tube rotator og roteres 360 ° ved 8 rpm natten ved 37 ° C. </li><li> Sentrifugerør ved 600 xg i 5 minutter. Kast supernatant fett og medium for destruksjon i samsvaring til institusjonelle bestemmelser. </li><li> Sjekk for ferdigstillelse av fordøyelsen ved å fortynne en liten alikvot av pelleten i medium. Fordøyelsen er fullført når mikroskopisk undersøkelse viser klumper av celler (organoids) med glatte vises duktale, alveolar eller ductal-alveolar strukturer fri vedlagte stroma (figur 1A). Reduksjon mammoplasty vev vil vanligvis fortsatt vise vedlagte stroma etter en overnatting fordøyelse og vil kreve ytterligere fordøyelsen tid. <ol class="lalpha"><li> Resuspender ufullstendig fordøyd pelleten i ferskt vev fordøyelsen blanding og re-inkuber med rotasjon ved 37 ° C i en annen 4-12 hr. Gjenta trinn 1,6 og 1,7. Om fordøyelse er fortsatt ufullstendig, igjen legge fordøyelsen blandingen til pelleten og re-inkuber med rotasjon ved 37 ° C over natten. Konsentrasjonen av enzymene kan reduseres for å hindre over-fordøyelsen natten. </li></ol></li><li> Når fordøyelsen er fullført, sentrifugerør ved 600 xg i 5 min, aspirer oppsummeringslisteion mix, resuspender pellet i medium pluss antibiotika på ca 15 ml/50 ml tube, 5 ml/15 ml tube. </li></ol> 2. Filtrering og Frysing av fordøyd materiale <ol><li> Overfør alikvoter av resuspenderte pellet til en steril 100 um sil over et sterilt 50 ml rør. La mediet renne ned i røret, så rewash de organoids på toppen 1-2x ganger med 2-3 ml medium. Gjenta til all resuspenderte pelleten er overført. Hvis det er for mange organoids på filteret og mediet ikke lenger drenerer lett, bruke et nytt filter (e) for det gjenværende materialet. Nøye flip filteret (e) på toppen av en annen sterilt rør og vaske organoids i røret med mer medium. Dette er 100 mikrometer organoid bassenget. </li><li> Ta materiale som drenert inn i den opprinnelige 50 ml rør og gjenta prosessen med 2,1 ved hjelp av en 40 um sil, for å få 40 mikrometer organoid pool, som inneholder for det meste alveolare strukturer. Materialet som drenert inn the tube utgjør filtratet bassenget, som inneholder enkle / små klumper av mesenchymale og epiteliale celler og små biter av blodkar. </li><li> Pellet de 100 um, 40 um, og filtratet bassengene ved 600 xg i 5 minutter. </li><li> Aspirer supernatanten rekonstitueres hvert rør i CPM II (DME/F-12 eller tilsvarende med 44% FCS og 6% DMSO) under anvendelse av omtrent 1 ml CPMII per 0,1 ml pakket pellet. Hold ved 4 ° C. </li><li> Seed en test rett for de to organoid bassengene ved å plassere 0,1 ml resuspenderte materiale i et 35 mm vevskultur plast tallerken dråpe for dråpe som i 3.2 nedenfor. Filtratet bassenget kan direkte sådd på vevskultur plast med fibroblast mediet (DME/F-12 eller tilsvarende med 10 ug / ml insulin og 10% FBS). </li><li> Alikvoter gjenværende resuspenderte materiale i Nunc attraksjon frysing Ampullene (1 ml / 2 ml ampulle). Frys natten ved -80 ° C og deretter overføre omgående til lagring i flytende nitrogen. Vi har ikke observert noe betydelig tap av levedyktigheti våre opprinnelige ampuller lagret frosset siden slutten av 1970-tallet. </li></ol> 3. Seeding Frosne Organoids og subkultur av Primær kulturer <ol><li> Raskt tine frosne ampullen inneholder organoids i en 37 ° C vannbad. Seed de organoids inn 2-10 (vanligvis ~ 6) 60 mm skåler, eller 1-3 100 mm skåler, avhengig visuell estimering av antall organoids i ampullen. Omtrent 20-40 organoids sådd per 60 mm parabolen er optimal. </li><li> Tinte organoids er nøye plassert, dråpe for dråpe, på tallerken overflaten med en 1 ml pipette eller Pasteur pipette for en jevn fordeling av organoids. Organoids plassert tett sammen vil ha begrenset plass for utvekst, som gir opphav til færre celler for subkultur eller fryser. Unngå å lage riper fatet overflaten (celler har en tendens til ikke å vokse de siste ripete overflater). Vent 1-2 min å la organoids å feste og deretter sakte legge vekstmedium for å unngå løsner organoids (f.eks 2-3 ml/60 mm parabol). Jegncubate ved 37 ° C i fuktig CO 2 inkubator. Dette er de primære kulturer. For tiden bruker M87A + oksytocin (X) medium for den mest robuste HMEC vekst (figur 2). </li><li> Etter en dag, sjekk at organoids er vedlagt. Legg til mer medium (f.eks 2-3 ml/60 mm parabol). Celle migrasjon fra organoids bør være synlig ved 24-48 hr, og mitotisk utvekst av 48-72 timer etter såing (figur 1B, C). Noen ganger vedlegget er dårlig etter 24 timer, spesielt hvis plating overdigested organoids eller organoids fra eldre kvinner, men de fleste forberedelsene vil legge innen 72 timer. Små stykker av blodkar kan feste og gi opphav til fibroblast celleutvekst (figur 1D). </li><li> Mate kulturer minst 3 ganger per uke. Celler dyrket i M87A-type medier vokse til nær konfluens innen 5-8 dager, avhengig av tettheten av såing. </li><li> Hvis det er betydelig fibroblast vekst, Differential trypsinisering (DT), basert pårask avløsning av fibroblaster fra overflaten plast, er nødvendig å fjerne de fibroblaster. Når epiteliale patcher blir store, aspirer media, vask parabolen (f.eks, 1-2 ml/60 mm parabol) med STE (saltvann, 0,05% trypsin, 0,02% EDTA), aspirat, legge friske 0,5 ml STE og la ved romtemperatur for rundt 1 min med kontinuerlig mikroskopisk observasjon. Når fibroblaster løsne men epitelcellene fremdeles vedheftende, forsiktig men kraftig banke siden av parabolen mot en hard overflate for å fjerne fibroblaster og deretter raskt aspirer. Vask en gang med PBS, og aspirere nytt. Kulturer sterkt forurenset med fibroblaster kan trenge en ekstra DT. </li><li> Subkultur primærkulturer når store epiteliale patcher er til stede, men før samløpet. Tettheten av organoid seeding og vedlegg vil påvirke den tiden som kreves. Å beholde den primære kultur og til å generere flere sekundære kulturer, fordelt over tid, utfører vi Partielle Trypsinizations (PT). </li><li> Aspirer media, vaske en 60 mm tallerken med 1-2 ml STE, tilsett 0,5 ml frisk STE til parabolen. Observere celle løsgjøring under mikroskopet ved romtemperatur i 1-5 minutter, med forsiktig banking på tallerken å fremme celle løsgjøring. Trypsinisering bør stoppes når ~ 50% av cellene har frittliggende. Tidlig PTS har vanligvis rask celle avløsning. For senere pts, kan cellene plasseres ved 37 ° C for raskere løsgjøring, med nøye overvåking, som alle cellene kan falle av raskt. </li><li> Tilsett 2 ml serum-holdige medier til parabolen, til repipette vaske, og overføre til en steril 15 ml tube. Gjenta 2x med en annen ~ 1-2 ml media, legger vask til røret. Refeed den primære parabolen og gå tilbake til inkubatoren. Telle celler i røret med haemocytometer. PTS kan gjentas rundt 4 til 8 ganger med god celle gjenvekst i de primære retter og tilsvarende langsiktig vekst fra subkultiveres eller frosne sekundærdeler (andre passasje cellene kalles secondaries, når subkultiveres, cellene er no longer primærvalg). Når organoid materiale er ikke lenger til stede i de primære kulturer, subkultiveres secondaries viser en nedgang i langsiktig befolkningen dobling potensial. </li><li><ol class="lalpha"><li> For subkultur til secondaries, frø celler direkte fra tuben til retter. Seeding på 1-2 x 10 5 cells/100 mm rett i en robust medium som M87A + X vil føre til samløpet i 4-7 dager. Vi legger koleratoksin til mediet på andre passasje for å øke proliferativ potensial, koleratoksin er utelatt i primær kultur fordi det fører til flere lag celleutvekst fra organoids. </li><li> For frysing som sekundærdelene, pellet tube ved 600 xg i 5 min, og resuspender i CPMII med en endelig tetthet av 10 6 celler / ml. Aliquot resuspendert celler inn Nunc attraksjon frysing ampuller, fryse over natten ved -80 ° C og deretter overføre omgående til lagring i flytende nitrogen. </li></ol></li><li> Det anbefales å fryse celler fra første PT for sikkerhets skyld, ogBruk celler fra andre PT for subkultur. Ytterligere PTS kan lagres frosset for fremtidig bruk. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Den menneskelige mammary vev prosesseringsmetode presenteres her muliggjør innhenting rene mammary epitelceller fra den heterogene blanding av celletyper i det menneskelige bryst. Filtrering gjennom porer fast størrelse tillater separasjon av forskjellige fraksjoner av melkekjertlene (f.eks ductal og ductal-alveolære vs alveolar) fra fordøyd stromal matriks. Isogene mammary fibroblaster kan fås å matche epitelceller. Frossen fordøyd materiale har beholdt god levedyktighet i over 30 år. Denne metoden har fungert hell på alle, men veldig fibrøse mammary vev, og er enkel å utføre. Andre varianter av mammary vev behandling eksisterer som ikke gir epiteliale fraksjoner som er like levedyktig, ren eller separert. Plassering av bearbeidede organoids i kultur med lave stress-induserende medier som M87A lar langsiktig vekst av HMEC med flere avstamning markører. HMEC som har blitt dyrket på plast fortsatt beholde muligheten til å generate 3D strukturer med normal in vivo-lignende avstamning relasjoner. Disse HMEC kulturer er egnet for omfattende eksperimentell undersøkelse, inkludert høy gjennomstrømning, med normal HMEC atferd og faktorer som kan drive eller hemme senescence og transformasjon.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glass Petriskål 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Saks 6,5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Tang 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Skalpeller disponibel </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Kollagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B sulfat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Trypsin 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Cell sil 100 mikrometer </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Cell sil 40 mikrometer </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Rør 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Rør 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC retter 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC retter 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kryorør </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Sentrifuger </td><td> Eppendorf-modell </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Eksperimentell undersøkelse av normal menneskelig mammary epitelceller (HMEC) adferd, og hvordan normale celler skaffe unormale egenskaper, kan lettes ved in vitro kultur systemer som mer nøyaktig modell in vivo biologi. Bruken av menneskelige avledet materiale for å studere cellulær differensiering, er aldring, senescence, og immortalization spesielt fordelaktig gitt mange viktige molekylære forskjeller i disse egenskapene mellom menneskelige og vanligvis benyttes gnagere celler 1-2. Mammary celler presentere en praktisk modell system fordi store mengder normale og unormale vev er tilgjengelig på grunn av hyppigheten av reduksjon mammoplasty og mastektomi kirurgi. Melkekjertlene består av en kompleks blanding av mange forskjellige celletyper, f.eks epiteliale, adipose, mesenchymale, endotelialceller. Epitelceller er ansvarlig for differensiert mammary funksjon av amming,og er også opphavet til det store flertallet av mennesker brystkreft. Vi har utviklet metoder for å behandle brystkjerteltumorer kirurgiske forkaste vev til ren epiteliale komponenter samt mesenchymalceller 3. Den prosesserte materialet kan lagres frosset på ubestemt tid, eller initiert i primær kultur. Kirurgisk Forkast materiale transporteres til laboratoriet og manuelt dissekerte å berike for epitelisk inneholdende vev. Etterfølgende fordøyelse av den dissekerte vev ved hjelp kollagenase og hyaluronidase strimler stromal stoff fra epitel ved basalmembran. De resulterende små stykker av epiteliale treet (organoids) kan atskilles fra fordøyd stroma ved sekvensiell filtrering på membraner av fast porestørrelse. Avhengig porestørrelse, kan fraksjoner oppnås bestående av større duktale / alveolar stykker, mindre alveolære klynger, eller stromal celler. Vi har observert overlegen vekst når kulturer er initiert som organoids enn som distilknyttede enkeltceller. Plassering av organoids i kultur ved hjelp av lav-stress inducing media støtter langsiktig vekst av normal HMEC med markører for flere avstamning typer (myoepithelial, luminal, stamfar) 4-5. Tilstrekkelig antall celler kan fås fra en individets vev for å tillate utstrakt eksperimentell undersøkelse ved standardiserte celle batcher samt spørresignaler bruker høye gjennomstrømning modaliteter. Cultured HMEC har vært beskjeftiget i en rekke studier som undersøkte normale prosesser som styrer vekst, differensiering, aldring og senescence, og hvordan disse vanlige prosesser blir endret under udødelig og malign transformasjon 4-15,16. Effektene av vekst i nærvær av ekstracellulært matriksmateriale, andre celletyper, og / eller 3D kulturen kan sammenlignes med veksten på plast 5,15. Helstøpt HMEC, starter med normale celler, gi en eksperimentelt medgjørlig system for å undersøke faktorer somkan drive eller hindre menneskelig aldring og kreftutvikling.

Representative tall for vev hensiktsmessig digestert organoids og plassert i kultur er vist i figur 1. Ufullstendig fordøyd vev viser materialet fortsatt festet til utsiden av disse strukturene, og vil trolig ha noen fibroblastic cellevekst i primær kultur, krever DT å fjerne. Overdigested vev vil vise mindre glatte ytre grenser, og det kan ta lengre tid å feste i grunnskolen kultur. Epithelial utvekst skal begynne innen 48-72 timer (1B, C). Små stykker av vaskulaturen (1D) kan være en kilde til mesenchymale celleutvekst. Epiteliale utvekster viser morfologisk heterogene populasjoner, med proliferativ populasjoner som inneholder blandinger av celler med markører assosiert med myoepithelial, stamfar, og luminal linjene (1E, 3C-E). Veksten i lavt stressnivå medier som M87A supplert med koleratoksin og oxytocin vil støtte overlegen langsiktigvekst av normal pre-stasis HMEC sammenlignet med tidligere media formuleringer (Figur 2). M87A-type media vil også støtte veksten av luminal og stamceller gjennom passasjer 4-8 (Tall 3C-E, 4); etterpå, de fleste celler viser bare myoepithelial avstamning markører. HMEC dyrket på plast kan beholde sin evne til å danne riktige 3D selvorganisering i micropatterned 3D mikrobrønnene med luminal celler interiør til korgcellene (figur 4A, B), og til å danne organiserte strukturer når belagt i Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. HMEC organoids og primær kultur. (A) Organoid viser ductal-alveolar struktur etter fordøyelse og filtrering. (B, C) viser Organoids ductal og alveolar struktur 2 dager etter plassering i primær kultur; Note begynnelsen cellen outgrowth (hvite piler). (D) Liten blodåre festet og med utgangspunkt fibroblast utvekst fra samme kulturer som B, C. (E) epithelial celleutvekst fra primær organoid kultur etter 4 dager. Linjene er identifisert ved farging med antistoffer mot K14 (rød) og K19 (grønn), atomkjerner ble farget med DAPI (blå). Luminal (K14-/K19 +, grønn), myoepithelial (K14 + / K19-, rød), og stamfar (K14 + / K19 +, gul) celler er synlige. Unstained celler observert i organoid kjernen på grunn av ufullstendig antistoff penetrasjon. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Vekst av HMEC kulturer i ulike medier formuleringer. Organoids hentet fra en enkeltperson, prøven 184, ble påbegynt i primær kultur ved hjelp av ulike medier formuleringer. Best langsiktig vekst oppnås ved hjelp av vår nyeste formulering, M87A + oxytocin (X) 4. Dette mediet støtter ogsåvekst av flere HMEC linjene (se fig. 1E). En tidligere media formulering, 3 MM gitt mindre robust vekst, mens en serum-frie medier, MCDB170 (kommersielle MEGM) 17 fører til rask induksjon av cyclin kinase inhibitor P16 INK4A og utvalg for avvikende celler 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figur 3. Sammenligning av avstamning mangfold i uncultured organoids og kultivert HMEC ved 4 th passasje. (A, B) FACS analyse av en uncultured, enzymatisk dissosiert organoid for (A) uttrykk for EpCAM og CD49f/alpha 6 integrin, og (B) CD227/Muc1 og CD10/CALLA. (C, D) FACS analyse av 4 th passasje pre-stasis HMEC for ekspresjon av (C) og EpCAM CD49f/alpha 6 integrin, og (D) og CD227/Muc1 CD10/CALLA. Identifiserbare populations er merket som LEP (uttrykker luminal markører EpCAM eller CD227), MEP (uttrykker myoepithelial markører CD49f eller CD10), eller PROG (anriket på CD49f + / EpCAM + befolkning). Vær oppmerksom på at i løpet av tilpasning til kultur regulering av EpCAM og CD49f endringer i forhold til uncultured organoids. (E) Unsorted HMEC og FACS-beriket LEP og MEP ved 4 th passasje farget for immunfluorescens analyse av keratin K14 (MEP markør) og K19 (LEP markør) for å verifisere avstamning identifikasjon. Nuclei farget med DAPI blå. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figur 4. Cultured HMEC kan danne organiserte strukturer med in vivo-lignende avstamning relasjoner når plassert i egnede microenvironments. (A) Pre-stasis 4 th passasje HMEC var FACS-beriket into luminal LEP og myoepithelial MEP linjene ved hjelp av markører for CD227 og CD10, med disse linjene verifisert av uttrykk for K14 og K19 (ikke vist). (B) Når det blandes sammen i micropatterned mikrobrønnene, var dyrkede celler i stand til selv-organisering i bilayers med MEP på utsiden og LEP intern [tilpasset fra Chanson et al. 5]. Fluorescensmerkede LEP (grønn) og MEP (rød) ble fotografert med en konfokal mikroskop ved 0 hr, 24 timer, og 48 timer etter tilsetning til mikrobrønnene (øvre). Kontroll HMEC ble vilkårlig merket med røde eller grønne fluorescerende etiketter (lavere). (C) Bright feltet bilde av FACS-beriket stamceller (cKit +) belagt i 3D (Matrigel) kultur og vokst i 18 dager. Resulterende strukturer kan vise alveolar morphogenesis. (D) Structures ble ekstrahert fra Matrigel og farget å oppdage K14 og K19, atomkjerner ble kontrafarget med DAPI. Immunofluorescerende analyse viser organisert strukturer med riktig luminal og basal polarity.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

En metode for å behandle humant mammary kirurgisk forkast materiale er beskrevet. Behandlet vev, i form av organoids, kan lagres frosset uendelige eller plassert i kultur for langsiktig vekst. Denne metoden muliggjør eksperimentelle undersøkelse av normal human epitelisk cellebiologi, og virkningene av eksogene perturbasjoner.

Behandling av humant Reduksjon mammoplasty og mastektomi Vev for Cell Culture

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolasjon, Kultur, og Imaging of Human Fetal Bukspyttkjertelen Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Menneskelig Dupuytrens<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur for studier av myofibroblasts og ekstracellulære matriks Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analysen fra Menneskelig Breast Cancer Vev og cellelinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbeide med menneskelig vev for translasjonell kreftforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivekulturmodell for studier av tumorcellemigrasjon og pasientspesifikke effekter av antiinvasjonsmidler

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensjonal Alginat-perle Culture of Human hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...