Name: processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

MAL, JCG och MRS stöds av NIA (R00AG033176 och R01AG040081) och Laboratory inriktad forskning och utveckling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.

1. Tissue Bearbetning och matsmältning <ol><li> Skaffa mänskliga bröst vävnad som kasserat material från kirurgiska ingrepp. Minskning mammoplasties kan ge normala eller godartade celler, fibroadenomas och gynecomastias ger godartade celler, icke-tumör mastektomi vävnader (perifert eller kontralateral till en tumör, eller subkutan) ger celler som kan variera från normal till godartad att innehåller microtumors. Säkerställ korrekt IRK godkännande finns innan erhålla kasserat material. Allt material ska behandlas under blodburna patogener föreskrifter. </li><li> Placera materialet i sterila behållare innehållande buffert eller medium (t.ex. 01:01 Dulbeccos modifierade Eagles medium och Hams F-12) kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 5 ng / ml Fungizone, 50U/ml polymyxin B, och 10% fetalt bovint serum, och transport till laboratoriet vid 4 ° C. Reduktion mammoplasty vävnad kan lagras eller transporteras vid 4 ° C under 72 timmar utan att signifikant påverka Subsequent cellviabilitet. Små bitar av icke-reduktion mammoplasty vävnad kan kräva mer snabb bearbetning. </li><li> Separera de epiteliala områden från stromala matrisen av fettvävnad, bindväv och blodkärl med användning av en kombination av steril skalpell pincett och sax. Klipp bitar av vävnad med sax och lägg i ett stort glas steril skål (t.ex. 150 mm). Försiktigt dissekera ut epiteliala områden, som visas som vita strimmor inbäddade i gulare stromal matrisen, med hjälp av pincett för att hålla materialet och skalpell för att skrapa bort det grovt fettmaterialet. För att underlätta matsmältningen, skär epitelvävnad i mindre bitar ~ 3-4 mm med motsatta skalpeller och lägg till en 50 ml provrör. Om stora mängder vävnad bearbetas, kan färska skalpellblad behövas. Ta fettmaterial från skålen för omhändertagande enligt institutionella regler. <ol class="lalpha"><li> I kraftigt fibrösa vävnader (t.ex. subkutana Mastectomies med svår fibrocystisk sjukdom), kommer det att finnas mer fast vitt, icke-epitelial materialet. Det kan vara svårt att dissekera ut epitelcellerna från sådana fibrösa matriser. Stora bitar av fibröst material kan skäras i mindre bitar som är ~ 1-3 mm kvadratisk yta och digererades separat. </li></ol></li><li> Placera den dissekerade epitelvävnad i ett koniskt centrifugrör (50 ml eller 15 ml) med vävnaden innefattar inte större än en tredjedel av volymen av röret. Ta röret upp till full volym, vilket innebär att endast en liten luftvolym för att för blandning under rotation, med användning av en blandning vävnad spjälkning (DME/F-12 eller motsvarande, 10 pg / ml insulin, antibiotika som ovan, och slutlig koncentration av 10 % FCS, 200 U / ml rå kollagenas och 100 U / ml hyaluronidas. </li><li> Placera rören på en HulaMixer rör rotator och rotera 360 ° vid 8 rpm över natten vid 37 ° C. </li><li> Centrifugera rören vid 600 xg under 5 minuter. Kasta supernatanten fett och medium för omhändertagande enligtning till institutionella regler. </li><li> Kontrollera för slutförande av digerering genom att späda en liten alikvot av pelleten i mediet. Uppslutning är klar när mikroskopisk undersökning visar klumpar av celler (organoids) med jämn visas duktala, alveolär eller duktal-alveolära strukturer fria från bifogade stroma (Figur 1A). Minskning mammoplasty vävnader vanligtvis visar fortfarande bifogade stroma efter en över natten matsmältning och kommer att kräva ytterligare koktiden. <ol class="lalpha"><li> Resuspendera ofullständigt digererade pelleten i färsk vävnad digereringsblandningen och re-inkubera med rotation vid 37 ° C under ytterligare 4-12 timmar. Upprepa steg 1,6 och 1,7. Om matsmältningen är fortfarande ofullständig, återigen lägga matsmältningen blandning till pelleten och åter inkubera med rotation vid 37 ° C över natten. Koncentrationen av enzymer kan minskas för att förhindra över-matsmältningen natten. </li></ol></li><li> När matsmältning är klar centrifugrör vid 600 xg under 5 minuter, aspirera sammandragion mix, resuspendera pelleten i medium plus antibiotika vid ungefär 15 ml/50 ml tub, 5 ml/15 ml tub. </li></ol> 2. Filtrering och frysning av Digested material <ol><li> Överför alikvoter av den återsuspenderade pelleten till en steril 100 fim sil över ett sterilt 50 ml rör. Låt mediet avloppet i röret, sedan rewash de organoids på topp 1-2x gånger med 2-3 ml medium. Upprepa tills allt av den återsuspenderade pelleten har överförts. Om det finns för många organoids på filtret och mediet inte längre avlopp lätt att använda ett nytt filter (ar) för återstående materialet. Försiktigt vända filtret (s) på en annan sterilt rör och tvätta organoids i röret med mer medium. Detta är den 100 um organoid poolen. </li><li> Ta materialet som dräneras in i den ursprungliga 50 ml tub och upprepa processen av 2,1 med användning av en 40 | im sil, för att erhålla 40 poolen xm organoid, som innehåller mest alveolära strukturer. Det material som dräneras in the rör utgör filtratet poolen, som innehåller enkla / små klumpar av mesenkymala och epiteliala celler och små bitar av kärlsystemet. </li><li> Pelletera 100 um, 40 um, och filtratet pooler vid 600 x g under 5 min. </li><li> Aspirera supernatanten, rekonstituera varje rör i CPM II (DME/F-12 eller motsvarande med 44% FCS och 6% DMSO) med användning av ca 1 ml per CPMII 0,1 ml packade pelleten. Håll vid 4 ° C. </li><li> Seed ett test maträtt för 2 organoid pooler genom att placera 0,1 ml återsuspenderad material till en 35 mm vävnadsodlingsplast maträtt droppe för droppe som under 3,2 nedan. Filtratet pool kan direkt ympas på vävnadsodlingsplast med fibroblast-medium (DME/F-12 eller motsvarande med 10 pg / ml insulin och 10% FBS). </li><li> Alikvotera resterande återsuspenderade materialet i Nunc ampuller typ frysning (1 ml / 2 ml ampull). Frys över natten vid -80 ° C och sedan överföra omedelbart till lagring i flytande kväve. Vi har inte observerat någon signifikant förlust av livsdugligheti vår ursprungliga ampuller lagras frysta sedan slutet av 1970-talet. </li></ol> 3. Sådd Frysta Organoids och subkultur av primära kulturer <ol><li> Snabbt tina frusna ampull innehållande organoids i en 37 ° C vattenbad. Frö av organoids i 2 till 10 (vanligtvis ~ 6) 60 mm skålar, eller 1-3 100 mm skålar, beroende på visuell uppskattning av antalet organoids i ampullen. Ungefär 20-40 organoids sådda per 60 mm skål är optimal. </li><li> Upptinade organoids noggrant placerade, droppe för droppe, på skålen yta med en 1 ml pipett eller pasteurpipett för en jämn fördelning av organoids. Organoids placerade nära varandra kommer att ha begränsat utrymme för utväxt, ger upphov till färre celler för subkultur eller frysning. Undvik att repa diskytan (celler tenderar att inte odla tidigare repad yta). Vänta 1-2 minuter för att låta organoids att fästa och sedan långsamt lägga tillväxtmedium för att undvika rubbning av organoids (t.ex. 2-3 ml/60 mm skål). Jagncubate vid 37 ° C i fuktad CO 2 inkubator. Dessa är de primära kulturerna. Vi använder för närvarande M87A + oxytocin (X) medium för de mest robusta HMEC tillväxt (figur 2). </li><li> Efter 1 dag, kontrollera att organoids bifogas. Lägg ytterligare medium (t.ex. 2-3 ml/60 mm skål). Cellmigrering från organoids ska synas med 24-48 timmar och mitotisk utväxt av 48-72 timmar efter sådd (Figur 1B, C). Ibland kvarstad är dålig efter 24 timmar, särskilt om plätering overdigested organoids eller organoids från äldre kvinnor, men de flesta förberedelser kommer att fästa inom 72 timmar. Små bitar av vaskulaturen kan fästa och ge upphov till fibroblastcellinje utväxt (figur 1D). </li><li> Feed kulturer minst 3 gånger per vecka. Celler odlade i M87A-materialtyp växa till nära konfluens inom 5-8 dagar, beroende på densitet sådd. </li><li> Om det finns betydande fibroblasttillväxt, differential trypsinisering (DT), baserat påsnabb avlossning av fibroblaster från ytan plast behövs för att ta bort fibroblaster. När epiteliala fläckar blir stora, aspirera medier, tvätta skålen (t.ex. 1-2 ml/60 mm skål) med STE (saltlösning, 0,05% trypsin, 0,02% EDTA), aspirera, tillsätt färsk 0,5 ml STE och låt stå i rumstemperatur för cirka 1 min med kontinuerlig mikroskopisk observation. När fibroblasterna lossnar men epitelcellerna fortfarande vidhäftande, försiktigt men kraftigt slå sidan av skålen mot en hård yta för att rubba fibroblasterna och sedan snabbt aspirera. Tvätta en gång med PBS, och aspirera igen. Kulturer kraftigt förorenade med fibroblaster kan behöva en extra DT. </li><li> Subkultur primära kulturer när stora epiteliala fläckar förekommer, men innan sammanflöde. Densiteten av organoid sådd och fastsättning kommer att påverka den tid som krävs. För att behålla den primära kulturen och för att generera flera sekundära kulturer, fördelade över tiden, gör vi Partiella Trypsinizations (PT). </li><li> Aspirera media tvätta en 60 mm skål med 1-2 ml STE, tillsätt 0,5 ml färsk STE att dela. Observera cell lossnar under mikroskop vid rumstemperatur under 1-5 min, med försiktig knackning av skålen för att främja cell lossnar. Trypsinisering bör avslutas när ~ 50% av cellerna har lossnat. Tidig PT har oftast snabb cell lossnar. För senare PTS kan celler placeras vid 37 ° C för snabbare lösgörande, med noggrann övervakning, eftersom alla celler kan lossna snabbt. </li><li> Tillsätt 2 ml serum-innehållande media till skålen, till repipette tvätta, och överför till ett sterilt 15 ml rör. Upprepa 2x med annan ~ 1-2 ml medium, tillsätta tvätt till röret. Refeed den primära skålen och återgå till inkubatorn. Räkna cellerna i röret med hemocytometer. PTS kan upprepas runt 4 till 8 gånger med god cell återväxt i de primära rätter och motsvarande långsiktiga tillväxt från subodlade eller frysta sekundärdelar (andra passagen celler kallas sekundära, en gång subkultiveras celler är inte longer primärvalen). När organoid material är inte längre förekommer i de primära kulturer, subodlade secondaries visar en nedgång i långsiktig populationsfördubblingstid potential. </li><li><ol class="lalpha"><li> För subkultur till sekundära, utsäde celler direkt från röret till rätter. Sådd av 1-2 X 10 5 celler/100 mm skål i en robust medium, såsom M87A + X kommer att leda till konfluens i 4-7 dagar. Vi lägger koleratoxin till mediet vid andra passagen för att öka proliferativ potential, koleratoxin utelämnas i primär kultur eftersom det leder till flerskiktade cell utväxt från organoids. </li><li> För frysning som sekundära, pellets röret vid 600 xg under 5 minuter, och resuspendera i CPMII med en slutlig densitet av 10 6 celler / ml. Alikvotera återsuspenderades cellerna i Nunc ampuller typ frysning, frysa över natten vid -80 ° C och sedan överföra omedelbart till lagring i flytande kväve. </li></ol></li><li> Det rekommenderas att frysa celler från den första PT för förvaring, ochanvända celler från den andra PT för subkultur. Ytterligare PTS kan frysas för framtida användning. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Den humana mammarvävnad bearbetningsmetod presenteras här möjliggör erhållande av ren mammära epitelceller från den heterogena blandningen av celltyper i den mänskliga bröst. Filtrering genom porer av fast storlek tillåter separation av olika fraktioner av bröstkörteln (t.ex. duktal och duktal-alveolära vs alveolära) från den spjälkade stromal matrisen. Isogena mammary fibroblaster kan erhållas för att matcha de epiteliala cellerna. Fryst ned materialet har behållit god lönsamhet i över 30 år. Denna metod har fungerat framgångsrikt på alla men mycket fibrösa bröst vävnader, och är enkel att utföra. Andra varianter av bröstvävnad bearbetning som varken ger epiteliala fraktioner som är så livskraftig, ren eller separerade. Placering av bearbetade organoids i kultur med låga stress-inducerande media såsom M87A tillåter långsiktig tillväxt av HMEC med MLK markörer. HMEC som har odlats på plast fortfarande kvar möjligheten att släktente 3D strukturer med normal in vivo-liknande härstamning relationer. Dessa HMEC kulturer är lämpliga för omfattande experimentell undersökning, inklusive hög genomströmning, normal HMEC beteende och faktorer som kan driver eller hämma åldrande och transformation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glas petriskål 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Sax 6,5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Tång 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Skalpeller disponibla </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Kollagenas </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidas </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizon </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B sulfat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Trypsin 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Cellfilter 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352.360 </td></tr><tr><td> Cellfilter 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td></tr><tr><td> Rör 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Rör 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC rätter 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC rätter 6 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kryogena flaskor </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifug </td><td> Eppendorf modell </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Experimentell undersökning av normal mänsklig bröst epitelcell (HMEC) beteende och hur normala celler förvärvar abnorma egenskaper, kan underlättas genom in vitro odlingssystem som mer exakt modell in vivo biologi. Användningen av mänskliga härrör material för att studera cellulär differentiering är åldrande, åldrande och immortalisering särskilt fördelaktigt med tanke på de många viktiga molekylära skillnader i dessa egenskaper mellan människor och allmänt utnyttjad gnagarceller 1-2. Mammarceller utgör ett bekvämt modellsystem då stora mängder av normala och onormala vävnader finns tillgängliga på grund av frekvensen av reduktion mammoplasty och operationer mastektomi. Bröstkörteln består av en komplex blandning av många olika celltyper, t.ex., epitelial, adipos, mesenkymal, endotel. Epitelcellerna är ansvariga för differentierade bröst funktion amning,och är också ursprunget till den stora majoriteten av humana bröstcancrar. Vi har utvecklat metoder för att behandla bröstkörteltumörer kirurgiska fångst som kastas överbord vävnader till rena epiteliala komponenter samt mesenkymala celler 3. Det bearbetade materialet kan förvaras frysta på obestämd tid, eller invigd i primär kultur. Kirurgisk kasserat material transporteras till laboratoriet och manuellt dissekerades för att anrika epitelial innehållande vävnad. Efterföljande digestion av den dissekerade vävnaden med kollagenas och hyaluronidas remsor stromalt material från epitelet vid basalmembranet. De resulterande små bitar av den epiteliala trädet (organoids) kan separeras från den digererade stroma genom sekventiell filtrering på membran av fast porstorlek. Beroende på porstorleken, kan fraktioner erhållas bestående av större duktala / alveolära bitar, mindre kluster alveolära eller stromaceller. Vi har observerat överlägsen tillväxt när kulturer initieras som organoids snarare än som disintressebolag enstaka celler. Placering av organoids i kultur med låg-stress inducerande media stödjer den långsiktiga tillväxten av normal HMEC med markörer för MLK typer (myoepithelial, luminala, stamfader) 4-5. Tillräckligt antal celler kan erhållas från en individs vävnad för att omfattande experimentell undersökning med standardiserade cell partier samt förhör med hög kapacitet modaliteter. Odlade HMEC har använts i ett stort antal studier undersökt de normala processer som styr tillväxt, differentiering, åldrande och åldrande, och hur dessa normala processer förändras under odödlig och malign transformation 4-15,16. Effekterna av tillväxt i närvaro av extracellulär matrix material, andra celltyper, och / eller 3D kulturen kan jämföras med en tillväxt på plast 5,15. Odlade HMEC, som börjar med normala celler, ger en experimentellt lätthanterlig för att undersöka faktorer somkan driva eller förhindra människans åldrande och cancer.

Representativa siffror för vävnader lämpligt smälta till organoids och placeras i kultur visas i figur 1. Ofullständigt ned vävnad visar materialet fortfarande fäst på utsidan av dessa strukturer, och kommer troligen att ha en viss fibroblastisk celltillväxt i primär kultur, kräver DT att ta bort. Overdigested vävnad visar mindre släta yttre gränser, och kan ta längre tid att fästa i primär kultur. Epitelial utväxt bör påbörjas inom 48-72 h (1B, C). Små bitar av vaskulatur (1D) kan vara en källa till mesenkymal cell-utväxt. Epiteliala utväxter visar morfologiskt heterogena populationer, med proliferativa populationer som innehåller blandningar av celler med markörer associerade med myoepithelial, stamfader, och luminala härstamningar (1E, 3C-E). Tillväxten i låg stress medier såsom M87A kompletterat med koleratoxin och oxytocin kommer att stödja bättre på lång sikttillväxt av normal pre-stasis HMEC jämfört med tidigare media formuleringar (figur 2). M87A-typ media kommer också att stödja tillväxt av luminala och progenitorceller genom passager 4-8 (figurerna 3C-E, 4), därefter flesta celler visar endast myoepithelial lineage markörer. HMEC odlas på plast kan behålla sin förmåga att bilda korrekt 3D självorganisering i micropatterned 3D mikrobrunnar med luminala celler inre till myoepithelial celler (figur 4A, B) och bilda organiserade strukturer när klädd i Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. HMEC organoids och primär kultur. (A) Organoid visar duktal-alveolär struktur efter rötning och filtrering. (B, C) Organoids visar duktal och alveolära strukturen 2 dagar efter placering i primär kultur, notera outgr börjar cellenowth (vita pilar). (D) Liten blodkärl fäst och med utgångspunkt fibroblast utväxt från samma kulturer som B, C. (E) Epitelcellsproliferation utväxt från primär organoid kultur efter 4 dagar. Härstamningar identifieras genom färgning med antikroppar till K14 (röd) och K19 (grön), kärnor färgades med DAPI (blå). Luminal (K14-/K19 +, grön), myoepithelial (K14 + / K19-röd) och stamfader (K14 + / K19 +, gul) celler är synliga. Ofärgade celler observeras i organoid kärnan på grund av ofullständig antikropp penetration. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Tillväxt av HMEC kulturer i olika medier formuleringar. Organoids erhållits från en individ, prov 184, inleddes i primär kultur med olika medier formuleringar. Bästa långsiktig tillväxt erhålls med vår senaste formulering, M87A + oxytocin (X) 4. Detta medium stöder ocksåtillväxt av flera HMEC linjerna (se figur. 1E). En tidigare medier formulering, MM 3 som mindre robust tillväxt, medan ett serum-fria medier, MCDB170 (kommersiell MEGM) 17 leder till en snabb induktion av cyklin-kinas-hämmaren P16 INK4A och urval för avvikande celler 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figur 3. Jämförelse av härstamning mångfald i okultiverade organoids och odlade HMEC vid 4: e passagen. (A, B) FACS analys av en obildad, enzymatiskt dissocierade organoid för (A) uttryck av EpCAM och CD49f/alpha 6 integrin, och (B) CD227/Muc1 och CD10/CALLA. (C, D) FACS-analys av 4: e passagen före stas HMEC för expression av (C) och EpCAM CD49f/alpha 6 integrin, och (D) och CD227/Muc1 CD10/CALLA. Identifierbara populations är märkta LEP (uttrycker luminala markörer EpCAM eller CD227), ledamot av Europaparlamentet (som uttrycker myoepithelial markörer CD49f eller CD10) eller PROG (anrikas i CD49f + / EpCAM + befolkning). Observera att under anpassningen till kultur reglering av EpCAM och CD49f förändringar jämfört med okultiverade organoids. (E) Osorterade HMEC och FACS-berikad LEP och parlamentsledamot vid 4: e passage färgas för immunofluorescensanalys av keratin K14 (MEP markör) och K19 (LEP markör) för att kontrollera härstamning identifiering. Kärnor färgades med DAPI verkar blå. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figur 4. Odlade HMEC kan bilda organiserade strukturer med in vivo-liknande härstamning relationer när placeras i lämpliga mikromiljöer. (A) före stas 4: e passagen HMEC var FACS-berikad into luminala LEP och myoepithelial linjer MEP med markörer för CD227 och CD10, med dessa linjer verifierade genom uttryck av K14 och K19 (ej visad). (B) När blandas i micropatterned mikrobrunnar var de odlade cellerna kan självorganisering i dubbelskikt med parlamentsledamot på utsidan och LEP intern [anpassade från Chanson et al. 5]. Fluorescensmärkta LEP (grön) och MEP (röd) avbildades med ett konfokalt mikroskop vid 0 h, 24 h, och 48 timmar efter tillsats till mikrobrunnarna (övre). Kontroll HMEC var godtyckligt märkta med röda eller gröna fluorescerande etiketter (lägre). (C) Ljusfält bild av FACS-anrikade progenitorceller (cKit +) utströks i 3D (Matrigel) kultur och odlades under 18 dagar. Resulterande strukturer kan uppvisa alveolär morfogenes. (D) Strukturer extraherades från Matrigel och färgades för att detektera K14 och K19, kärnor motfärgades med DAPI. Immunofluorescerande analys visar organiserade strukturer med rätt luminal och basal Polahet.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

En metod att bearbeta humant bröst kirurgiskt kasserat material beskrivs. Bearbetade vävnader, i form av organoids kan frysas på obestämd tid eller placeras i kultur för långsiktig tillväxt. Denna metod möjliggör experimentell undersökning av normal mänsklig epitelceller biologi och effekterna av exogena störningar.

Behandling av mänskliga Minskning mammoplasty och vävnader mastektomi för cellodling

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Utföra och behandling FNA av främre Fat Pad för Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primär hjärntumör Mjukpapper för analyser stamceller och Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primär kultur av Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Humant Dupuytrens<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur för studien av Myofibroblaster och extracellulära matrixinteraktioner

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analys från Human bröstcancer vävnader och cellinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbeta med mänskliga vävnader för translationell cancerforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

En humant glioblastom organotypisk skivkulturmodell för studie av tumörcell migrering och patientspecifika effekter av antiinvasiva läkemedel

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...