Name: local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag DA030396. Tack vare medlemmarna i Drenan labbet för hjälp diskussion och kritik av manuskriptet. Särskilt tack till Mi Ran Kim för tekniskt bistånd och Jonathan Thomas Ting för råd om vuxna skivor mushjärna.

1. Beredning av lösningar för Brain skiva Förberedelser och elektrofysiologi <ol><li> Lösningar för framställning av hjärnsnitt har tidigare beskrivits 3, 4. Framställning av N-metyl-D-glukamin (NMDG)-baserad skärning och återvinning lösning med följande sammansättning (i mM): 93 N-metyl-D-glukamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCOs 3, 20 HEPES, 25 glukos, 5 Na + askorbat, 2 tiourea, 3 Na + pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2...

<ol>
	<li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+activation+of+?4*+receptors:+sufficient+for+reward,+tolerance,+and+sensitization.">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized,+high-affinity+?6*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li><li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li><li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction.">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li><li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum.">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li><li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons.">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li><li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+?4*+nicotinic+receptors:+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path.">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li><li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+?4?2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li><li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior.">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+&#945;6&#946;4*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by &#945;6&#946;4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li><li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+&#945;4&#946;2*-,+&#945;6&#946;2*-,+&#945;3&#946;4*-+and+&#945;7-nicotine+acetylcholine+receptors.">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native &#945;4&#946;2*-, &#945;6&#946;2*-, &#945;3&#946;4*- and &#945;7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+trafficking,+pentameric+assembly,+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+&#945;6+and+&#946;3+subunits.">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled &#945;6 and &#946;3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li><li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons.">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li><li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area.">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors.">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li><li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons.">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222 (2010).</li><li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ventral+tegmental+area+revisited:+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons.">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li><li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex.">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li><li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons.">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li><li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus.">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li><li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors.">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li></ol>

Metoden som presenteras i detta dokument är i stort sett användbar för att studera ligand-gated funktion jonkanal i beredningar hjärnan slice. Det finns emellertid ett antal faktorer som väsentligt påverkar kvaliteten och reproducerbarheten av experimentella data som resulterar från användning av denna metod. Till exempel, framkallade strömmar är mycket känsliga för diametern av spetsen av läkemedlet fyllda pipett. Små tips kommer att orsaka problem med att mata ut läkemedelslösningen och stora tips med ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-Methyl D-glucamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M2004</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3911</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S9638</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S6014</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H3375</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glucose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5767</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na+ ascorbate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A4034</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T8656</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na+ pyruvate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2256</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4&bull;7H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>230391</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2&bull;2H20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>223506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S9625</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na+ pentobarbital</td>
 <td>Vortech Pharmaceuticals</td>
 <td>76351315</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>potassium gluconate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G4500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E3889</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9187 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G8877 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DSK-Zero 1 Vibrating slicer</td>
 <td>Ted Pella, Inc.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P-97 Flaming/Brown micropipette puller</td>
 <td>Sutter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RC-27 Recording chamber</td>
 <td>Warner</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TC-344B Perfusion heater controller</td>
 <td>Warner</td>
 <td>640101</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SH-27B Solution heater</td>
 <td>Warner</td>
 <td>640102</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon FN-1</td>
 <td>Nikon</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-7500 CCD Video camera</td>
 <td>Hamamatsu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer III</td>
 <td>General Valve Co.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MP-285 Micromanipulator </td>
 <td>Sutter </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PA-100 Piezoelectric translator </td>
 <td>piezosystem jena, Inc.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12V40 piezo amplifier</td>
 <td>piezosystem jena, Inc.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B</td>
 <td>Molecular Devices Corp.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A</td>
 <td>Molecular Devices Corp.</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices

Tobaksbruk leder till många hälsoproblem, inklusive cancer, hjärtsjukdomar, emfysem och stroke. Beroende av cigarettrökning är en utbredd neuropsykiatrisk störning som härrör från de biofysiska och cellulära åtgärder nikotin på nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) hela det centrala nervsystemet. Förstå olika nAChR subtyper som finns i områden i hjärnan som är relevanta för nikotinberoende är en viktig prioritering. Experiment som använder elektrofysiologi tekniker såsom hela celler patch clamp eller två-elektrodspänningen inspelningar klämma är användbara för farmakologisk karakteristik av nAChR av intresse. Celler som uttrycker nAChR, såsom däggdjursceller vävnadsodlingskolvar eller Xenopus laevis oocyter, är fysiskt isolerade och är därför lätt studeras med hjälp av verktygen i modern farmakologi. Stora framsteg har gjorts med användning av dessa tekniker, särskilt när målreceptorn var redan känt ennd ektopisk uttryck lätt att uppnå. Ofta är det dock nödvändigt att studera nAChR i sin naturliga miljö: i nervceller i hjärnan skivor akut skördas från laboratorium möss eller råttor. Till exempel möss som uttrycker &quot;överkänsliga&quot; nAChR subenheter såsom α4 L9&#39;A möss 1 och α6 L9&#39;S möss 2, möjliggöra entydig identifikation av neuroner baserat på deras funktionella uttryck av en specifik nAChR subenhet. Även hel-cell patch clamp inspelningar från nervceller i hjärnan skivor rutinmässigt görs av skickliga electrophysiologist, är det svårt att lokalt tillämpa läkemedel såsom acetylkolin eller nikotin till det inspelade cell inom en hjärna skiva. Utspädning av läkemedel i superfusate (bad ansökan) är inte snabbt reversibla, och U-rör-system är inte lätt anpassas för att arbeta med hjärnsnitt. I detta dokument beskriver vi en metod för att snabbt applicera nAChR-aktiverande läkemedel till nervceller som spelats in i vuxen mOuse hjärnsnitt. Standard helcells-inspelningar görs från neuroner i skivor, och en andra mikropipett fylld med ett läkemedel av intresse manövreras i läge nära den inspelade cellen. En injektion av trycksatt luft eller inert kväve i läkemedels-fyllda pipett orsakar en liten mängd läkemedel lösning som skall sprutas ut från pipetten på det inspelade cellen. Med denna metod, nAChR-medierade strömmar kan lösas med millisekund noggrannhet. Drug Application gånger kan lätt varieras, och läkemedlet fyllda pipett kan dras tillbaka och ersättas med en ny pipett, vilket möjliggör koncentration-respons-kurvor skapas för en enda neuron. Även beskrivet i samband med nAChR neurobiologi, bör denna teknik vara användbar för att studera många typer av ligandstyrda jonkanaler eller receptorer i neuroner från hjärnsnitt.

In our experiments, we routinely record from dopamine (DA)-producing neurons of the ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNc). In voltage-clamp mode, pressure application of acetylcholine or nicotine to these cells will typically result in a rapid, inward cation current that reaches peak within 100-200 msec (Figure 1A-B). Decay of the current is largely dictated by diffusion of the drug from the site of action, and whether enzymes in the slice are present to metabolize the dru...

Watch this Scientific Journal Video about Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

I detta dokument beskriver vi en användbar metod för att studera ligand-gated funktion jonkanal i nervceller i akut isolerade hjärnsnitt. Denna metod innefattar användning av en drog-fyllda mikropipett för lokal applicering av läkemedel till neuroner som spelats in med standardtekniker patch clamp.

Lokal applicering av läkemedel att studera Nicotinic Funktion acetylkolinreceptorn i skivor mushjärna

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Cholinergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

HSV-medierad transgenexpression av chimära konstruktioner för att studera Behavioral funktion GPCR Heteromers i möss

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Hela-cell strömmar induceras av Puff tillämpningen av GABA i hjärnan skivor

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metod att studera primära händelser i Neurodegeneration använder Ex Vivo råtta hjärnan skivor

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Inspelning och modulering av Epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor kopplat till mikroelektrod matriser

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Sondera Nicotinic acetylkolin Receptor funktion i mus hjärnan skivor via Laser Flash fotolys Photoactivatable nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation av hela-kortikala Electrocorticographic matris i Marmosettapa

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...