Name: isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Alle procedurer er blevet gennemgået og godkendt af University of Pennsylvania IACUC. 1. EDL Dissektion og klargøring (Ca. 30 min) <ol><li> Bedøve mus til at sikre, at de oplever ingen smerter eller angst under proceduren, men at musklerne forbliver godt iltet af cirkulation. Vi anvender rutinemæssigt en ketamin / xylazin cocktail (100/10 mg / kg) injiceret via IP. Kirurgisk plan af anæstesi bestemmes ved fuldstændig mangel på pedalen eller palpedral tilbagetrækning reflekser, eller mangel på øre twitch respons. </li><li> Immobilisere baglemmer med medicinsk tape, og fjern skindet af den nedre forreste bagben for at blotlægge musklerne i dette område. Hold musklerne fugtig med anvendelsen af ​​PBS med jævne mellemrum. </li><li> Under et dissektionsmikroskop, lave et lille snit lateralt til knæet for at eksponere den proksimale senen af ​​EDL muskler. Der er to sener i denne region, og begge skal skæres for at aktivere removal af EDS. </li><li> På den mediale ankel, skære senen af TA musklen til at eksponere de distale sener EDL, der strækker sig langs meta tarsals. Løft TA muskel ud af den måde, at man passer på ikke at skære eller røre EDL nedenunder. Vend tilbage til de distale sener EDL, snip hver enkelt og trække dem gennem anklen, så griber de sener, forsigtigt trække EDL væk fra resten af ​​benet. Det bør frigive fra den proximale ende frit, men hvis ikke, vender tilbage til den laterale indsnit for at sikre, at senen skæres. Fjern muskel og sted i en dissekere fad fyldt med kølede oxygenerede Ringers. Pin musklen gennem senerne ved ca hvilende længde, hvilket er længden fundet in vivo. Længden er for kort, når musklen er slapt i skålen, og for lang, hvis musklen trækker på dissekering ben. </li><li> Aflive musen umiddelbart efter muskel fjernet ved cervikal dislokation. </li><li> Tie suturer til de tidons, så tæt som muligt på muskler, men ikke rører musklen. Pin musklen ved ca hvile længde ved hjælp af suturer. </li></ol> 2. Membran Dissection og klargøring (Ca. 30 min) <ol><li> Aflive musene forud for denne procedure ved cervikal dislokation under anæstesi, hvis den samme mus udsættes for begge dissektioner, eller ved CO2 efterfulgt af bekræftelse med cervikal dislokation. </li><li> Lave et snit i huden for at blotlægge den abdominale og brysthulen. Åbne bughulen, og skære kropsvæggen lige under ribbenene. Ved hjælp knogle saks, og begyndende over membranen insertion, skåret omkring hele brystkassen efter linien af ​​ribberne, og snit gennem rygsøjlen. Skåret blodkar løber gennem centrum af membranen, således at membranen kan fjernes let. </li><li> Fjern membranen fra musen, og sted i en dissekere fad fyldt med iltet Ringers. Ryst forsigtigt DIAPhragm i skålen for at vaske væk blod. Refresh Ringers opløsning efter behov. </li><li> Skær en lille strimmel af membranen fra den centrale senen til ribberne langs orienteringen af ​​fibrene i den centrale del af de sideværts hemidiaphragms. Strimlen skal være mellem 2-4 mm brede. Ved hjælp knogle saks, ribben skæres på begge sider af strimlen, hvilket efterlader ca 1-2 mm overhæng ribbe på hver side af membranen strimlen. </li><li> Binde suturer til det centrale senen. Bind sutur til hver af de lateralt udragende ribbe ender, og derefter binde disse sammen til en stor sløjfe. </li><li> To strimler kan opnås fra en given membran (en fra hver side). </li></ol> 3. Montering Muskler i Mechanics Bath <ol><li> Fat suturerne og anvende disse til at fastgøre musklen til en stiv stilling i den ene ende, og til en krafttransducer i den anden ende. </li><li> Justere længden for at sikre musklen er ikke slap, men er ikke stram. En god tilnærmelse er hvilested muscle længde som i 1,4 - 1,5. </li><li> Bad skal fyldes med oxygeneret Ringers-opløsning holdt ved 22 ° C for at forlænge muskel stabilitet til testning. Muskler skal hvile i 5 minutter i dette bad forud for funktionel afprøvning, således at muskel temperaturen er ækvilibreret til 22 ° C. </li></ol> 4. Isometriske kontraktioner <ol><li> Etablere supramaximal Stimulation Betingelser. Efter en muskel er placeret i badet, kan du bruge en enkelt 0,5 msek stimulationsimpulser at generere en spjæt, og overvåge force output. Gradvist øge strømmen, indtil den kraft opnår en maksimal men stabilt niveau. Forøg strøm til 10% mere end dette niveau i de resterende eksperimenter. </li><li> Etablere optimal længde. Anvendelse af isometriske ryk stimulationer, justerer længden af ​​musklen gradvist, indtil en maksimal styrke opnås. Rest musklen ~ 10 sek mellem hver kontraktion. Optimal muskel længde (L o) er nået, når twitch kraft er maksimal. Optag muskel længde (længden værelem de myotendinous kryds for EDL og mellem det centrale sene myotendinous vejkryds og muskel indsættelse til ribben) ved hjælp af Vernier calipre. </li><li> Maksimal Isometrisk tetaniske Force. Stimulere muskler fastsat til L o i en periode på 500 msek, med en serie af 0,5 msek pulser ved supramaximal stimulation og ved fusionsfrekvens (fra plateauet af frekvensen-force forhold (f.eks Ref:. 8) plateau for EDL muskler er typisk opnået med 120 Hz, og for mellemgulvet muskler med 100 Hz. Stimulere 3 gange på de respektive frekvens med hvileperioder af 5 min mellem stimulering bouts for hver muskel. </li></ol> 5. Excentriske Sammentrækninger <ol><li> Tillad muskler til at hvile 5 min mellem at udføre isometriske og excentriske kontraktioner. </li><li> Stimulere muskler ved 80 Hz isometrisk til den oprindelige 500 msek, efterfulgt af en 10% L o stretch i den endelige 200 msek stimulation (en strækning på 0,5 L o/ Sek). </li><li> Gentag stimulation mønster med 5 min hviler mellem for det ønskede antal excentriske kontraktioner. </li><li> Mål kraft for hver sammentrækning i den periode forud for stretch. Beregn faldet i kraft mellem den første og sidste kontraktion. </li></ol> 6. Muskel Slettelse Apparatus <ol><li> Afkort muskel længde for at muliggøre skånsom fjernelse af musklen fra transduceren og send og returnere det til en dissekere fad med Ringers. </li><li> Fjern suturer fra muskler. </li><li> For EDL muskel, skamplet musklen to gange, vejes, inden den efterfølgende behandling (f.eks frysning, fastsættelse, etc). Dette vil være vigtigt til at beregne tværsnitsareal, og specifik kraft. </li><li> For membranen muskel, lægges i blød i 0,1% Procion orange, en membran impermeabel farvestof i 15-20 min. Dette vil tilvejebringe et indeks for dissektion beskadigelse. </li><li> Dissekere musklen væk fra den benede insertion, samt central senen. Dette er nødvendigt for at tilvejebringe en nøjagtig vægt af musklen. Blot som ovenfor før vejning og efterfølgende forberedelse. </li><li> Beregn tværsnitsareal (CSA): CSA (mm2) = masse (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm3)], hvor L / L o er fiberen til muskel længde forhold (0,45 til EDL, 1,0 for membranen) 5 og 1,06 er massefylden af musklen. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Aurora Scientific.

Målet med denne artikel er at give vejledning til at udføre isoleret muskel-funktionen på to muskler fra mus - EDL og mellemgulvet. Evaluering af disse muskler kan give indsigt i, hvorvidt terapeutiske kandidater til muskel sygdom er gavnlige. For begge muskler, er den vigtigste faktor i at få solide data en ren dissektion. Ved at praktisere og perfektionere den oprindelige isolering trin er vigtigt, før du flytter ind på funktionelle test. Desuden er indførelse af funktionelle benchmarks for normal muskel kritisk inden du gør sammenligninger til dystrofisk muskel, eller mellem behandlingerne. Dette vil sikre, at undersøgelsens resultater ikke under høj variabilitet bibringes ved evnen hos den person der udfører forsøgene. Anvendelsen af ​​en membran impermeabel farvestof kan hjælpe med at optimere dissektion præparat, inkubering af en muskel i en opløsning indeholdende et sådant farvestof vil markere de beskadigede fibre, og kan tjene som et indeks for dissection succes. Minimering af antallet af fibre beskadiget i musklen vil bidrage til at optimere målingen. Fibrene beskadiget ved dissektion fluorescerer meget mere lyst end dem beskadiget ved excentrisk kontraktion, og så hvis farvestoffet også anvendes under den mekanik proces, kan man bruge intensiteten af ​​farvestoffet til at skelne mellem de to typer af skader. Dissektion af membran strimler vil næsten altid fiberbeskadigelse, fordi ved at skære langs længden af ​​fibrene, nogle uundgåeligt blive ødelagt. Farvestofoptagelse er stærk i disse beskadigede fibre, og disse er normalt begrænset til de ydre kanter af præparatet. I gennemsnit observere vi et bånd af beskadigede fibre, som er ~ 3 fibre i bredden (~ 120 um) på hver side af musklen strimlen. Hvis den beskadigede bånd omfatter mere end 15% af musklen, så den går data tabt. Membranen præparat har også begrænsninger på den optimale størrelse for funktionelle foranstaltninger. Det har vist sig, at stykker af diaphragm, der er større end 5 mm begynder at folde sig på sig selv, idet den centrale senen slips kun på et punkt. Dette resulterer i nedsat specifik kraft i præparatet. Vi har også fundet, at smalle strimler også har lavere specifik kraft, som vi finder fordi antallet af fibre beskadiget under dissektion omfatter en større del af den samlede fibermængde nummer. For eksempel, hvis 0,1 mm på hver side er beskadiget så er 5% (2x0.1 mm / 4 mm strimler) af musklen præparat, der ikke bidrager til at tvinge, hvorimod hvis strimlen er kun 1 mm, derefter 20 % af musklen præparatet er beskadiget. Således kan både bredden af ​​den beskadigede region samt bredden af ​​hele præparationen er vigtige faktorer til kontrol. Målinger af maksimal isometrisk spænding kræver, at alle muskelfibre i en muskel er stimuleret. Fordi der er enorm variabilitet i de dele af en funktion apparatur, skal det bestemmes for hvert enkelt sætop. For eksempel kan bath størrelse eller type af stimulatoren påvirke intensiteten af ​​stimulering. Twitch stimulation er en fornuftig måde at afgøre supramaximal stimulation betingelser. Når dette er fastlagt for en særlig opsætning og muskel, kan det anvendes til efterfølgende undersøgelser. I modsætning hertil bør den optimale længde af en given muskel, der skal måles for hvert præparat ved hjælp af den iterative proces beskrevet ovenfor. Dette sikrer, at tykke og tynde filamenter overlap er optimal, og den maksimale potentielle kraft produktionskapacitet måles. Alternative procedurer kan stole på diffraktionsmønstrene forbundet med muskel riller, men det kræver ekstra udstyr ikke er beskrevet her. Vi rutinemæssigt bruger 500 ms stimulation varigheder, der falder i midten vifte af denne parameter anvendes af andre forskere på dette område. Selv om dette kan medføre en vis træthed af musklen under sammentrækning, hvilket er tydeligtaf en &quot;synke&quot; i den maksimale kraft produktionen, kan dette i sig selv være oplysende. For eksempel kan en forskel i træthed opnås ved forskellige behandlinger, herunder dem, der er målrettet calcium håndtering, således nedsynkningen gældende i aktiv kontraktion kan tjene som et indeks for forbedringer. Alternativt kan tabet af kraft viser, at suturerne på senerne ikke er tætte nok, og at de glider under sammentrækning. Musklen skal fjernes fra badet og suturerne skal re-bundet, hvis dette sker. Vi bruger også en serie på 3 tetaniske sammentrækninger, som hjælper vurdere stabiliteten af ​​præparatet. Igen vil sutur glider føre til tab af kraft mellem veerne, som kræver sutur re-binde. Store muskler kan også generere anoxiske kerner, som fører til tab af kraft i protokollen. Muskel størrelse er en begrænsende faktor for at udføre isoleret muskelfunktion test, hvor EDL muskler med masser på over 20 mg mister kraft med hver entretion, og som ikke kan understøttes af superfusionsapparatet i et bad. Membran strimler lider ikke af de samme komplikationer, fordi de er tynde nok til at have langvarig levedygtighed i badet. Andre muskler kan anvendes til isoleret muskelfunktion, herunder soleus-muskel, der er almindeligt anvendt, men ikke er beskrevet her. Mange af de samme procedurer kan vedtages for soleus med hensyn til forberedelse og den funktionelle test. Imidlertid de væsentligste forskelle er i stimuleringen frekvens, og parametrene for excentriske kontraktioner. Anvendelse af soleus til funktion supplerer de to andre muskler, og så det bør betragtes som en del af en &quot;standard pakke&quot; for at vurdere dystrofe mus 4, 7. Excentrisk kontraktion giver et indeks for kontraktile skrøbelighed, og det er vigtigt at bruge en protokol, der resulterer i beskedne tab af kraft i musklerne fra vildtype dyr og et betydeligt tab af kraft iubehandlede dystrofiske muskler, så der er et stort dynamikområde for sammenligninger. En mangel på nogen kraft tab i normale muskler viser, at den excentriske kontraktion er for mild, og vil ikke være hensigtsmæssige til at skelne mellem terapier, der ikke er effektive og dem, som drages fordel. Dog kan en dramatisk tab af kraft i normale muskler udsat for excentrisk kontraktion være for stor til at drille de forskelle, der er forbundet med sygdommen. Vores protokol for EDL og membranen anvender en 0,5 Lo / sek stretch rate til at producere en 10% længde forandring. Vi udfører typisk 5 excentriske kontraktioner, der resulterer i en lille tab af magt i normale muskler og et betydeligt tab af kraft i dystrofe muskler. Ganske vist kan alle disse parametre varieres for at forøge den samlede længdeændring, graden af ​​strækning, eller antallet af excentriske kontraktioner for at skelne forskelle mellem sygt og sundt muskelvæv samt om virkningerne af en specifik type af mutation eller tEHANDLING man studerer. Så længe der er en markant forskel mellem normale og sygdomsramte muskler, så er der en guld standard for at nå til i form af behandlinger. Sammenfattende fastslår denne protokol retningslinjer for udførelse af isometriske og excentriske kontraktioner, og forhåbentlig identificerer de potentielle faldgruber for at undgå, når du indstiller denne teknik op i dit laboratorium.

Muskelfunktion målinger bidrager til evalueringen af ​​potentielle behandlinger for muskel patologi, såvel som til bestemmelse af mekanismer bag fysiologi i dette væv. For muskel sygdom, har brugen af ​​musemodeller blevet et centralt element for at forstå sammenhængen mellem genotype og fænotype, og for at udvide denne viden i design og afprøvning af potentielle lægemidler. De muskeldystrofier især påberåbt har på mus til at evaluere disse midler og etablere prækliniske data, der kræves for at komme videre til forsøg i patienter. En hyppig effektmål bruger isoleret muskel funktion til at bestemme styrken, som gælder for en lang række undersøgelser. En anden foranstaltning er anvendelsen af ​​excentriske, eller forlængelse, for sammentrækninger bestemme ændringer i muskel membranintegritet, som er deficient med Duchenne muskeldystrofi, og musemodellen for denne sygdom (MDX). Derfor er det vigtigt, at disse typer af measuremforældre til at være følsom og reproducerbar. Muse extensor digitorum longus (EDL) muskel er blevet anvendt i vid udstrækning til isolerede muskelfunktion grund af sin ideelle geometri og størrelse, herunder ensartet fiberorientering og endelige sener 2, 5, 6, 10, 12. Fremgangsmåder til EDL muskler isometriske funktionelle målinger er blevet beskrevet i en tidligere publikation Jove 8, såvel som i behandlingen NMD SOP 1. Vi har udvidet beskrivelse af disse metoder til at omfatte både isometriske og excentriske kontraktioner. Kendetegnende for sygdom er tydelig i EDL, herunder heighted cykler af degeneration / regenerering og formindsket kraft output. Musen membran udviser den hurtigste patologiske progression af muskelsvind i forhold til andre muskler i mus 11. Ved 6 måneders alderen, omfatter kumulativ fibrose omkring 50% af musklen. Dette resulterer i signifikant impaired force output 11. Derfor kan terapeutiske midler, der kan forhindre fibrotisk infiltration afvikles effektivt i membranen. Tabet af dystrofin i muskel fører til øget skrøbelighed og øget kontraktile skader i alle muskler 9. Derfor er mange behandlinger for Duchenne muskeldystrofi er gearet til dystrophin udskiftning. Som sådan er et assay, der er blevet af afgørende betydning for evaluering af disse strategier excentrisk kontraktion, som kan skelne mellem normal og dystrofisk muskel og bestemme, hvilken nytte en særlig strategi til beskyttelse af en dystrofisk muskel fra kontraktile skader 2, 3, 4, 12. Denne procedure kræver enten en dual-mode servomotor, som kan modulere / record længde og styrke, eller en fremgangsmåde til tilpasning af længden hurtigt adskilt fra en krafttransducer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / Material </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> in vitro Muskel Test System </td><td> Aurora Scientific </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE lyskilde </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Dissekere saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 14.060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Vinklede dissekere saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 15.006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpelhåndtaget </td><td> Fin Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td> suppleant dissektionsinstrument </td></tr><tr><td> Buet skalpelblade # 12 </td><td> Fin ScienceVærktøj </td><td> 10.012-00 </td><td> suppleant dissektionsinstrument </td></tr><tr><td> Bone saks </td><td> Fin Science Tools </td><td> 16.044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutur tying pincet </td><td> Fin Science Tools </td><td> 00.272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS pincet - vinklet </td><td> Fin Science Tools </td><td> 11.203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Flettet silkesutur size 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Medicinsk tape </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketaminhydrochlorid 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Final dosis er 80 mg / kg </td></tr><tr><td> TranquiVed Injection (xylazin 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Final dosis er 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reaktiv appelsin 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Ringers opløsning Komponenter </td><td></td><td></td><td> Opløsningen er gas ækvilibreret med 95% O2 og 5% CO2, endelig pH 7,4 </td></tr><tr><td> Natriumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Slutkoncentration: 118 mM </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Slutkoncentration: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Calciumchloriddihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Slutkoncentration: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Monobasisk kaliumphosphat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Slutkoncentration: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Slutkoncentration: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethansulfonsyre (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Slutkoncentration: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Slutkoncentration: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Kritisk for evalueringen af ​​potentielle lægemidler til muskelsygdom er følsomme og reproducerbare fysiologiske vurderinger af muskelfunktion. Fordi mange prækliniske forsøg er afhængige af musemodeller for disse sygdomme, har isoleret muskelfunktion blevet en af ​​standarderne for go / Nogo beslutninger i bevægelse lægemiddelkandidater frem i patienter. Vi vil demonstrere udarbejdelsen af ​​extensor digitorum longus (EDL) og mellemgulvet muskler for funktionel test, der er de fremherskende muskler anvendt til disse undersøgelser. Den EDL muskel geometri er ideel til isolerede muskel præparater, med to lettilgængelige sener, og en lille størrelse, der kan understøttes af superfusionsapparatet i et bad. Membranen udviser dyb progressiv patologi i dystrofe dyr, og kan tjene som en platform for at vurdere mange potentielle terapier imødegåelse fibrose og fremme myofiber stabilitet. Protokoller for rutinemæssig afprøvning, herunder isometrisk og eccentrisk sammentrækninger, vil blive vist. Isometrisk kraft tilvejebringer vurdering af styrke og excentriske kontraktioner fremme evalueringen sarcolemma stabilitet, der er afbrudt i mange typer af muskeldystrofier. Sammenligninger af de forventede resultater mellem muskler fra vildtype og dystrofisk muskler vil også blive givet. Disse foranstaltninger kan supplere morfologiske og biokemiske målinger af væv homeostase, såvel som hele dyr vurderinger af muskelfunktion.

Forventede værdier for de isometriske kræfter EDL muskler fra 12 uger gamle dyr er vist i figur 1.. Fordi mdx muskler udviser kompenserende hypertrofi, kan den samlede tetanic kraft være højere i MDX muskler i forhold til alder matchede vildtype kontroller. En mere passende mål for funktionel udgang er bestemt kraft (fig. 2), hvor kraft normaliseres for tværsnitsareal at beregne denne værdi. Specifik kraft afhænger af den iboende funktionelle kapacitet af musklen, hvor den svage dystrofe muskler er mere tydeligt, når både absolut styrke og tværsnitsarealet der tages højde for. I vores hænder, generere EDL muskler fra mdx-mus cirka 20 - 25% lavere specifikke kræfter end af alder matchede vildtype mus fra 10 til 26 uger gamle. For membranen, er kun specifik kraft relevant for sammenligninger, fordi præparatet er et stykke af musklen afhænger thesektion. Sammenligning af specifik kraft mellem vildtype og mdx mellemgulvet muskler afspejler den gradvise patologi i dette væv. Isometrisk kraft output falder med alderen (figur 3), således at der ved 6 måneders alderen, mellemgulvet muskler fra mdx-mus producerer ikke mere end halvdelen af den funktionelle produktion af membran strimler fra alder-matchede vildtype kontroller. Et eksempel på excentriske kontraktioner fra membran test er vist i figur 4.. Med hver efterfølgende excentrisk kontraktion, mindsker force output i membran strips fra både vildtype (C57) og mdx-mus. Men tabet af kraft er mere dramatisk i muskler prøver fra mdx-mus, formentlig fra fraværet af dystrofin og dets associerede proteiner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figur 1. Isometrisk tetanic kraft i vildtype og MDX EDL muskler f<html> rom 12 uger gamle mus. Absolut kraft kan være højere i aldersmatchede mdx EDL muskler på grund af kompenserende hypertrofi. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figur 2. Isometrisk tetanisk kraft normaliseres ved muskel tværsnitsareal er bestemt kraft, og afslører trykket funktionelle kapacitet EDL muskler fra mdx-mus sammenlignet med dem for vildtype-mus. Spor er de samme mus som i figur 1. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figur 3. Den gradvise tab af kraft produktionskapacitet vurderes af specifik kraft er tydeligst i mellemgulvet af mdx-mus (røde søjler) sammenlignet med vildtype (C57 i blå linie). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. Tabet af magt som en funktion af excentrisk kontraktion nummer for mellemgulvet muskler fra 12 uge gammel C57 og mdx-mus. Data er middel ± SEM for n = 4 muskler pr genotype.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Muskelfunktion målinger bidrager til evalueringen af ​​potentielle lægemidler for muskel patologi, såvel som til bestemmelse af mekanismer bag fysiologi i dette væv. Vi vil demonstrere udarbejdelsen af ​​extensor digitorum longus og mellemgulvet muskler for funktionel test. Protokoller for isometriske og excentriske kontraktioner vil blive vist, samt forskelle i resultater mellem dystrofiske muskler, der repræsenterer en patologisk tilstand, og vildtype muskler.

Isometrisk og Excentrisk styrkeopbygningsprocessen Vurdering af skeletmuskulatur isoleret fra murine modeller af muskeldystrofier

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Den Ex vivo Isoleret Skeletal mikrokardannelse Forberedelse til undersøgelse af vaskulær reaktivitet

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysning af modeller af Skeletmuskel Sygdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Kontraktilitet Målinger på isolerede papillærmuskler for undersøgelse af Cardiac inotropi i mus

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design og Udvikling af aptamer-Gold Nanopartikel kolorimetrisk Analyser for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Isolering myofibrils fra skeletmuskulatur biopsier og bestemmelse kontraktile funktion med en Nano-Newton resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Måling af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskulatur fra mus

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...