Name: isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania IACUC. 1. EDL Dissection en voorbereiding (ongeveer 30 min) <ol><li> Verdoven muizen zodat zij geen pijn of angst tijdens de procedure ervaren, maar dat de spieren blijven en zuurstof door de circulatie. We routinematig gebruik van een ketamine / xylazine cocktail (100/10 mg / kg) geïnjecteerd via IP. Chirurgische vlak van anesthesie wordt bepaald door volledige afwezigheid van pedaal of palpedral terugtrekking reflexen, of het ontbreken van het oor spierrespons. </li><li> Immobiliseren de achterpoten vast met tape en verwijder de huid van de onderste voorste achterbeen naar de spieren van dit gebied bloot te leggen. Om de spieren vochtig met de toepassing van PBS regelmatig. </li><li> Onder een ontleedmicroscoop scope, een kleine incisie dwars op de knie om de proximale pees van de EDL spier bloot. Er zijn twee pezen in dit gebied, en beide worden gesneden re toestaatUitbouwen van de EDL. </li><li> Op de mediale enkel, snijd de pees van de TA spier aan de distale pezen van de EDL, die zich langs de meta tarsals bloot te leggen. Til de TA spier uit de weg, en let niet te snijden of raken de EDL eronder. Terug naar de distale pezen van de EDL, snip elk en trek ze door de enkel, dan grijpen de pezen, zachtjes weg te trekken van de EDL van de rest van de ledemaat. Het dient vrij te geven vanaf het proximale uiteinde, zo niet terug naar de laterale incisie dat de pees wordt gesneden. Verwijder de spieren en doe dit in een dissectie schotel gevuld met gekoeld zuurstofrijk Ringers. Pin de spier de pezen ongeveer resting lengte, de lengte in vivo. De lengte is te kort wanneer de spier slap is in de schaal, en te lang als de spier trekt aan de ontleden pinnen. </li><li> Onmiddellijk euthanaseren de muis na verwijdering spier door cervicale dislocatie. </li><li> Bind hechtingen de tienDons, zo dicht mogelijk bij de spier, maar niet tegen de spier. Speld de spier op ongeveer rustplaats lengte met behulp van de hechtingen. </li></ol> 2. Membraan Dissection en voorbereiding (ongeveer 30 min) <ol><li> Euthanaseren de muizen voorafgaand aan deze procedure door cervicale dislocatie onder verdoving als dezelfde muis wordt onderworpen aan beide secties, of CO 2 gevolgd door een bevestiging met cervicale dislocatie. </li><li> Een insnijding in de huid van de buik-en borstholte bloot. Open de buikholte, en snijd het lichaam muur net onder de ribben. Met bot schaar en beginnen boven het membraan inbrengen snede rondom het gehele ribbenkast de lijn van de ribben, en hakte rug. Snij bloedvaten die door het midden van het membraan, zodat het membraan kan eenvoudig worden verwijderd. </li><li> Verwijder het membraan van de muis, en plaats in een dissectie schotel gevuld met zuurstofrijk Ringers. Schud voorzichtig de DIAPhragm in de schaal weg te wassen bloed. Refresh Ringers oplossing nodig. </li><li> Snijd een smalle strook van het membraan van de centrale pees aan de ribben langs de oriëntatie van de vezels in het centrale deel van de laterale hemidiaphragms. De strip moet tussen 2-4 mm breed. Met bot knippen als de rib ter weerszijden van de strook, waardoor ongeveer 1-2 mm overhang van rib aan weerszijden van het membraan strip. </li><li> Bind hechtingen aan de centrale pees. Hechtdraad binden aan elk van de zijdelings uitstekende rib uiteinden en knoop die een grote lus. </li><li> Twee stroken kan worden verkregen bij elk membraan (een per kant). </li></ol> 3. Montage Spieren in Mechanics Bath <ol><li> Pak de hechtingen en deze gebruiken om de spieren hechten aan een vaste plaats aan het ene uiteinde en een krachtopnemer aan de andere kant. </li><li> Pas de lengte te zorgen dat de spier is strak, maar is niet strak. Een goede benadering is de rustplaats muscle lengte als in 1.4 - 1.5. </li><li> Bad moet worden gevuld met zuurstof Ringers oplossing gehandhaafd op 22 ° C om spieren stabiliteit verlengen testen. Spieren moeten rusten gedurende 5 min in dit bad voor functionele tests, zodat spiertemperatuur is geëquilibreerd tot 22 ° C. </li></ol> 4. Isometrische contracties <ol><li> Bepaal supramaximale Stimulatie Voorwaarden. Na een spier wordt in een bad geplaatst en gebruik van eenmalig 0,5 msec stimulatie pulsen naar een twitch genereren en bewaken kracht output. Verhoog geleidelijk stroom totdat de kracht bereikt een maximum, maar stabiel niveau. Verhoging leiden tot 10% meer dan dit niveau voor de overige experimenten. </li><li> Bepaal optimale lengte. Met isometrische twitch prikkelingen, geleidelijk de lengte van de spier tot een maximale kracht wordt verkregen. Plaats de spier ~ 10 sec tussen elke contractie. Optimale spierlengte (L o) wordt bereikt wanneer twitch kracht maximaal is. Record spierlengte (de lengtetussen de knooppunten voor myotendinous EDL, en tussen de centrale pees myotendinous junctie en de spier insertie van de rib) met schuifmaten. </li><li> Maximale Isometrische Tetanische Force. Stimuleren spier ingesteld op L o gedurende 500 msec, met een reeks van 0,5 msec pulsen bij supramaximale stimulatie en fusion frequentie (het plateau van de frequentie-force relatie (bv. Ref:. 8) Het plateau voor EDL spieren meestal bereikt met 120 Hz, en voor diafragma spieren met 100 Hz. Stimuleer 3 keer op de respectievelijke frequentie rusttijden van 5 min tussen stimulatie gevechten voor elke spier. </li></ol> 5. Excentrische contracties <ol><li> Laat spier tot 5 min tussen het uitvoeren van isometrische en excentrische contracties rusten. </li><li> Stimuleren spieren bij 80 Hz isometrisch voor de eerste 500 msec, waarna 10% L o rek in de laatste 200 msec stimulatie (een stuk van 0,5 L o/ Sec). </li><li> Herhaal stimulatie patroon met 5 min rust tussen het gewenste aantal excentrische contracties. </li><li> Meet kracht voor elke contractie in de periode voorafgaand aan de rekken. Bereken de daling in kracht tussen de eerste en laatste contractie. </li></ol> 6. Muscle verwijderen uit het apparaat <ol><li> Verkort de spierlengte te zorgen voor zachte verwijdering van de spier van de transducer en de plaatsen en terug te sturen naar een dissectie schotel met Ringers. </li><li> Verwijder hechtingen van de spieren. </li><li> Voor de EDL spier, twee keer vlek de spier, weeg, voordat verdere verwerking (bijv. bevriezing, bevestiging, enz.). Dit zal belangrijk zijn voor de berekening van de doorsnede en specifieke werking. </li><li> Voor het middenrif spier, genieten in 0,1% Procion oranje, een membraan impermeant kleurstof voor 15-20 minuten. Dit zal een index van dissectie schade. </li><li> Ontleden de spieren buiten het benige insertie, evenals de central pees. Dit is noodzakelijk om een ​​nauwkeurige gewicht van de spier verschaffen. Dep zoals hierboven voorafgaand aan het wegen en latere uitwerking. </li><li> Bereken doorsnede (CSA): CSA (mm2) = massa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)] waarbij L / L o de vezel spierlengte ratio (0,45 EDL, 1,0 voor het membraan) 5 1,06 en de dichtheid van spier. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Aurora Scientific.

Het doel van dit artikel is om een ​​leidraad voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie op twee spieren van muizen - de EDL en het middenrif. Evaluatie van deze spieren kan inzicht geven in het al dan niet therapeutische kandidaten voor spierziekte nuttig zijn. Voor beide spieren, de belangrijkste factor bij het verkrijgen van betrouwbare gegevens is een schone dissectie. Daarom oefenen en perfectioneren van de oorspronkelijke isolatie stap is essentieel alvorens op functionele testen. Bovendien, tot oprichting van functionele maatstaven voor normale spier is van cruciaal belang voor het maken van vergelijkingen met dystrofische spieren, of tussen de behandelingen. Dit zorgt ervoor dat de onderzoeksresultaten niet onder hoge variabiliteit verleend door het vermogen van de persoon die de experimenten. Het gebruik van een membraan impermeant kleurstof kan helpen bij het optimaliseren van de dissectie preparaat, incubatie van elke spier in een oplossing die een dergelijke kleurstof meest beschadigde vezels markeren, en kan dienen als een index van dissection succes. Minimaliseren van het aantal vezels in de spier beschadigd zal helpen om de meting te optimaliseren. De vezels beschadigd door dissectie fluoresceren veel feller dan beschadigd door excentrische contractie en dus als de kleurstof wordt eveneens gebruikt voor de mechanische proces, kan de intensiteit van kleurstof gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee soorten schade. Dissectie van membraan strips zullen bijna altijd vezelbeschadiging, omdat door te snijden langs de lengte van de vezels, wat onvermijdelijk kapot gaat. Dye opname sterk in de beschadigde vezels en deze zijn normaal beperkt tot de buitenranden van het preparaat. Gemiddeld zien we een band van beschadigde vezels die ~ 3 vezels in breedte (~ 120 um) aan weerszijden van de spier strip. Als de beschadigde band omvat meer dan 15% van de spier, worden de gegevens verwijderd. Het membraan voorbereiding heeft ook beperkingen op de optimale grootte voor functionele maatregelen. We hebben gevonden dat stukken diaphragm breder dan 5 mm beginnen te vouwen op zichzelf, omdat de centrale pees tie slechts in een punt. Dit resulteert in een verminderde specifieke kracht in het preparaat. We hebben ook ontdekt dat smallere stroken ook lager specifieke kracht, waarvan wij geloven dat hebben, omdat het aantal vezels beschadigd tijdens dissectie bestaan ​​uit een groter deel van de totale vezelmassa nummer. Als bijvoorbeeld 0,1 mm aan elke kant is beschadigd, dat 5% (2x0.1 mm / 4 mm strip) van de spier preparaat dat niet bijdraagt ​​aan dwingen, terwijl indien de strip slechts 1 mm, vervolgens 20 % van de spiervoorbereiding beschadigd. Dus zowel de breedte van het beschadigde gebied en de breedte van het gehele preparaat belangrijke factoren te controleren. Metingen van maximale isometrische spanning vereisen dat alle spiervezels in een spier worden gestimuleerd. Omdat er een enorme variabiliteit in de componenten van een functie inrichting, moet dit worden bepaald voor elke afzonderlijke setup. Zo kan bad grootte of het type stimulator invloed op de intensiteit van de stimulatie. Twitch stimulatie is een redelijke manier om supramaximale stimulatie voorwaarden te bepalen. Zodra dit is vastgesteld voor een specifieke situatie en spieren, kan het worden gebruikt voor verdere studies. In tegenstelling tot de optimale lengte van een gegeven spier moet worden gemeten voor elk preparaat met de iteratieve proces hierboven beschreven. Dit zorgt ervoor dat dikke en dunne filamenten overlap is optimaal en de maximale potentiële kracht genererende capaciteit wordt gemeten. Alternatieve procedures kunnen rekenen op de diffractie patronen die door de spier strepen, maar dit vereist extra apparatuur hier niet beschreven. We routinematig gebruik 500 msec stimulatie lengtes, dat valt in het middengebied van deze parameter worden gebruikt door andere onderzoekers op dit gebied. Hoewel dit enkele vermoeidheid van de spier veroorzaken tijdens de contractie, zoals blijktdoor een &quot;sag&quot; in de maximale kracht productie kan dit op zichzelf informatief. Zo zou een verschil in vermoeidheid worden bereikt door verschillende therapieën, waaronder die welke beogen calcium behandeling, vandaar de doorbuiging die tijdens actieve contractie kan dienen als een index voor verbetering. Alternatief kan het verlies van kracht dan dat de hechtingen op de pezen niet stevig genoeg, en dat zij glijden tijdens de contractie. De spier wordt verwijderd uit het bad en de hechtingen opnieuw worden verbonden als dit gebeurt. We gebruiken ook een reeks van 3 tetanische contracties, waardoor evaluatie van de stabiliteit van het preparaat. Nogmaals, zou hechtdraad slips leiden tot verlies van kracht tussen de weeën, die hechting opnieuw koppelverkoop. Grote spieren kan ook leiden tot anoxische kernen, die leiden tot verlies van geweld tijdens het protocol. Spiermassa is een beperkende factor voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie testen, waar EDL spieren met massa&#39;s van meer dan 20 mg te verliezen kracht bij elke contractueletie, en kan niet worden ondersteund door superfusie in een bad. Membraan strips hebben geen last van dezelfde complicaties, omdat ze dun genoeg om langdurige levensvatbaarheid hebben in het bad. Andere spieren kan worden gebruikt voor geïsoleerde spier functie, met inbegrip soleus, die gewoonlijk wordt gebruikt, maar hier niet beschreven. Veel van dezelfde procedures kunnen worden vastgesteld voor de soleus in termen van het preparaat en de functionele testen. De belangrijkste verschillen zijn in de stimulatie frequentie en de parameters voor excentrische contracties. Gebruik van de soleus voor functie vult die van de andere twee spieren, en daarom moet worden beschouwd als onderdeel van een &quot;standaard pakket&quot; gaan dystrofe muizen 4, 7. Excentrische contractie geeft een index van contractiele breekbaarheid en het is belangrijk om een ​​protocol dat resulteert in verlies van bescheiden werking in spieren van wildtype dieren een aanzienlijk verlies van kracht inonbehandelde dystrofische spieren zodat er een groot dynamisch bereik voor vergelijkingen. Een gebrek aan kracht verliezen in normale spieren suggereert dat de excentrische contractie te mild en niet toereikend te onderscheiden therapieën die niet effectief en die echt gunstig. Echter, een dramatisch verlies van kracht in de normale spieren onderworpen aan excentrische contractie te groot om te plagen uit verschillen die verband houden met de ziekte. Onze protocol voor de EDL en het middenrif maakt gebruik van een 0,5 Lo / sec stretch tarief voor de productie van een 10% lengteverandering. We voeren gewoonlijk 5 excentrische contracties, die resulteren in een klein verlies van kracht in normale spieren en een significant verlies van werking in dystrofische spieren. Uiteraard kunnen al deze parameters worden gevarieerd om de lengte veranderen, de mate van rek, of het aantal excentrische contracties verhogen om verschillen tussen zieke en gezonde spier, alsmede de effecten van een bepaald type mutatie onderscheiden of tEHANDELING men studeert. Zolang er een duidelijk verschil tussen normale en aangetaste spieren, dan is er een gouden standaard te bereiken in termen van behandelingen. Kortom, dit protocol worden richtsnoeren vastgesteld voor het uitvoeren van isometrische en excentrische contracties, en hopelijk identificeert de mogelijke valkuilen te vermijden bij het instellen van deze techniek in uw lab.

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van mogelijke behandelingen van spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. Voor spierziekte, hebben het gebruik van muismodellen uitgegroeid tot een centraal onderdeel voor het begrijpen van de relatie tussen genotype en fenotype, en voor de uitbreiding van die kennis in het ontwerpen en testen van mogelijke therapeutica. De spierdystrofieën, in het bijzonder, hebben vertrouwd op muizen om deze middelen te evalueren en pre-klinische gegevens die nodig zijn om verder te gaan naar onderzoeken bij patiënten vast te stellen. Een frequent gebruikt uitkomstmaat geïsoleerde spier functie kracht, die van toepassing is op een groot aantal studies bepalen. Een andere maatregel is het gebruik van excentrische of verlenging, contracties bepalen veranderingen in spier membraan integriteit, die deficiënt is in Duchenne spierdystrofie en het muismodel voor deze ziekte (mdx). Daarom is het voor dit soort Metingents gevoelig en reproduceerbaar. De muis extensor digitorum longus (EDL) spier is veelvuldig gebruikt voor geïsoleerde spierfunctie vanwege de ideale geometrie en afmetingen, waaronder uniforme vezeloriëntatie en definitieve pezen 2, 5, 6, 10, 12. Werkwijzen voor EDL spieren isometrisch functionele metingen zijn beschreven in een eerdere publicatie Jupiter 8, en in de behande-NMD SOP 1. We hebben uitgebreid de beschrijving van deze methoden om zowel isometrische en excentrische contracties op te nemen. Kenmerken van de ziekte zijn duidelijk in de EDL, met inbegrip van heighted cycli van degeneratie / regeneratie en verminderde kracht output. De muis membraan vertoont de snelste pathologische progressie van spierdystrofie vergelijking met andere spieren in de muis 11. Door leeftijd van 6 maanden, cumulatief fibrose omvat ongeveer 50% van de spier. Dit resulteert in aanzienlijk slechtziendend kracht uitgang 11. Daarom kunnen geneesmiddelen met fibrotische infiltratie voorkomen efficiënt worden geëvalueerd in het membraan. Het verlies van dystrofine in de spieren leidt tot een verhoogde kwetsbaarheid en verhoogde contractiele schade in alle spieren 9. Daarom zijn er veel therapieën voor de ziekte van Duchenne zijn afgestemd op dystrofine vervanging. Als zodanig een assay die essentieel is geworden voor het evalueren van deze strategieën is excentrische contractie, die onderscheid kunnen maken tussen normale en dystrofische spier, en bepalen welk voordeel een bepaalde strategie voor het beschermen van dystrofe spierweefsel contractiele schade 2, 3, 4, 12. Deze procedure vereist een dual-mode servo-motor die moduleren / recordlengte en kracht, of een werkwijze voor het aanpassen lengte snel los van een krachtopnemer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> in vitro Muscle Test System </td><td> Aurora Wetenschappelijke </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE lichtbron </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angled ontleden schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpelhouder </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td> alternatieve dissectie-instrument </td></tr><tr><td> Gebogen scalpelmesjes # 12 </td><td> Fine ScienceGereedschap </td><td> 10.012-00 </td><td> alternatieve dissectie-instrument </td></tr><tr><td> Bone schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16.044-10 </td><td></td></tr><tr><td> W &amp; T-hechtdraad koppelverkoop tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 00.272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS pincet - hoek </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Gevlochten zijden hechtdraad grootte 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Medische tape </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine hydrochloride 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Laatste dosis is 80 mg / kg </td></tr><tr><td> TranquiVed Injection (xylazine 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Uiteindelijke dosis is 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reactieve oranje 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Ringers oplossing Components </td><td></td><td></td><td> Oplossing gas geëquilibreerd met 95% O2 en 5% CO2 uiteindelijke pH 7,4 </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Eindconcentratie: 118 mM </td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Eindconcentratie: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Calciumchloridedihydraat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Eindconcentratie: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Eindconcentratie: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfaat </td><td> JT Baker </td><td> 2500 tot 01 </td><td> Eindconcentratie: 0,57 mm </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) pipeRazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Eindconcentratie: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Eindconcentratie: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Cruciaal belang voor de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spierziekte gevoelig en reproduceerbaar fysiologische beoordeling van spierfunctie. Omdat veel pre-klinische studies rekenen op muismodellen voor deze ziekten, heeft geïsoleerde spierfunctie uitgegroeid tot een van de normen voor Go / NoGo beslissingen bij het verplaatsen van kandidaat-geneesmiddelen naar voren in patiënten. We demonstreren de bereiding van de extensor digitorum longus (EDL) en middenrif voor tests, die voornamelijk spieren gebruikt voor deze studies. De EDL spier geometrie is ideaal voor geïsoleerde spier preparaten met twee gemakkelijk toegankelijke pezen en een klein formaat dat kan worden ondersteund door superfusie in een bad. Het membraan vertoont diepe progressieve pathologie in dystrofische dieren, en kan dienen als een platform voor het evalueren van veel potentiële therapieën tegengaan van fibrose, en het bevorderen van myofiber stabiliteit. Protocollen voor het routinematig testen, met inbegrip van isometrische en eccentric contracties getoond. Isometrische kracht levert beoordeling van sterkte en excentrische contracties helpen sarcolemma stabiliteit, hetgeen wordt verstoord in vele soorten spierdystrofieën evalueren. Vergelijkingen van de verwachte resultaten tussen spieren van wild-type en dystrofische spieren zal ook worden verleend. Deze maatregelen kunnen aanvullen morfologische en biochemische metingen van weefsel homeostase, alsmede gehele dier beoordeling van spierfunctie.

Verwachte waarden voor de isometrische krachten van EDL spieren van 12 weken oude dieren worden getoond in Figuur 1. Omdat mdx spieren vertonen compenserende hypertrofie, kunnen de totale tetanische kracht hoger in mdx spieren vergeleken met leeftijd afgestemd wildtype controles. Echter, een passende maatregel van functionele uitgang specifieke kracht (figuur 2), waarbij kracht genormaliseerd voor dwarsdoorsnedeoppervlak deze waarde te berekenen. Specifieke werking afhankelijk van de inherente functionele capaciteit van de spier waar de zwakke dystrofische spieren duidelijker wanneer zowel absolute kracht en dwarsdoorsnede worden verwerkt. In onze handen EDL spieren mdx muizen genereren ongeveer 20 - 25% lagere specifieke krachten dan die van wildtype muizen overeenstemmende leeftijd 10 tot 26 weken. Voor het membraan alleen specifieke kracht is relevant voor vergelijkingen omdat het preparaat een stuk van de spier afhankelijk van de Dissectie. Vergelijking van de specifieke kracht tussen wildtype en mdx middenrif spieren weerspiegelt de progressieve pathologie in dit weefsel. Isometrische kracht uitgang afneemt met de leeftijd (figuur 3), zodat door leeftijd van 6 maanden, middenrif spieren van mdx muizen niet meer dan de helft van de functionele output van diafragma stroken van dezelfde leeftijd wildtype controles worden uitgeoefend. Een voorbeeld van excentrische contracties van membraan tests getoond in figuur 4. Met elke volgende excentrische contractie, kracht-uitgang vermindert in de membraan strips van zowel wildtype (C57) en mdx muizen. Het verlies van kracht dramatischer in spieren monsters van mdx muis vermoedelijk uit de afwezigheid van dystrofine en geassocieerde eiwitten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figuur 1. Isometrische tetanische kracht in wildtype en mdx EDL spieren f<html> rom 12 weken oude muizen. Absolute kracht kan hoger zijn in dezelfde leeftijd mdx EDL spieren als gevolg van compenserende hypertrofie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figuur 2. Isometrische tetanische kracht genormaliseerd door spier dwarsdoorsnede is specifieke kracht, en toont depressief functionele capaciteit van EDL spieren mdx muizen vergeleken met die van wildtype muizen. Sporen van dezelfde muizen als in figuur 1. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figuur 3. De progressief verlies van kracht productiecapaciteit bepaald door specifieke kracht is het duidelijkst in het middenrif van de mdx muizen (rode balken) in vergelijking met wildtype (C57 in blauwe lijn). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Het verlies van kracht als functie van excentrische contractie nummer middenrif van 12 weken oude C57 en mdx muizen. Gegevens gemiddelde ± SEM voor N = 4 spieren per genotype.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype spieren.

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Samentrekbaarheid Metingen op Geïsoleerde papillairspieren voor onderzoek naar Cardiac inotropie in Muizen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...