Name: isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פול ד Wellstone השיתופי מרכז המחקר (AR052646).

כל הנהלים כבר נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. 1. Dissection והכנה אדי (כ 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים על מנת להבטיח שהם חווים ללא כאב או מצוקה במהלך ההליך, אבל שיישארו את שרירי חומצן היטב על ידי המחזור. אנו משתמשים באופן שגרתי קוקטייל קטמין / xylazine (מ&quot;ג 100/10 / ק&quot;ג) מוזרק באמצעות IP. מטוס כירורגית של הרדמה נקבע על עדר מוחלט של דוושה או רפלקסים גמילה palpedral, או חוסר תגובת עווית אוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את hindlimbs באמצעות קלטת רפואית, ולהסיר את העור של hindlimb הקדמי הנמוך לחשוף את השרירים של אזור זה. לשמור על השרירים לחים עם היישום של PBS במרווחי זמן קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ביתור, עושה חתך לרוחב בברך קטן במטרה לחשוף את הגיד הפרוקסימלי של שריר האד. ישנם שני גידים באזור זה, ושניהם צריכים להיות חתוכים כדי לאפשר מחדשmoval של אדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרסול המדיאלי, לחתוך את הגיד של שריר ת&quot;א לחשוף את הגידים הדיסטלי של אדי, שמשתרעים לאורך tarsals meta. הרם את שרירי ת&quot;א מהדרך, נזהר שלא לקצץ או לגעת במתחת האד. חזור אל הגידים הדיסטלי של אדי, מקצץ כל אחד ולמשוך אותם דרך הקרסול, ואז תופס את הגידים, משוך בעדינות את האד משאר האיברים. זה צריך לשחרר מקצה הפרוקסימלי בחופשיות, אבל אם לא, יחזור לחתך הרוחבי על מנת להבטיח שהגיד הוא לחתוך. הסר את השריר ומניח בצלחת מלאה בביתור Ringers חומץ מצונן. הצמד את השריר באמצעות הגידים באורך כ מנוחה, שהוא מצא באורך vivo. האורך קצר מדי כאשר השריר רפוי בצלחת, וארוך מדי, אם השריר מושך על פיני מנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באופן מיידי לאחר הסרת שריר על ידי נקע בצוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את התפרים ל10דונים, קרוב ככל האפשר לשריר, אבל לא נוגעים בשרירים. הצמד את השריר באורך כ מנוחה באמצעות התפרים. </li></ol> 2. Dissection סרעפת והכנה (כ 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים לפני הליך זה על ידי עקירת צוואר רחם בהרדמה, אם אותו העכבר הוא נתון לשני הניתוחים, או על ידי CO 2 אחרי אישור עם נקע בצוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור כדי לחשוף את חלל בטן ובחזה. פתח את חלל הבטן, וחותך את קיר הגוף בדיוק מתחת לצלעות. בעזרת מספרי עצם, ומתחיל מעל לכניסת הסרעפת, עקפה את כל הצלעות בעקבות השורה של הצלעות, והחתך דרך עמוד שדרה. חותך כלי דם, שעובר במרכזה של הסרעפת, כך שניתן להסיר בקלות את הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרעפת מהעכבר, ומעביר לכלי ביתור המלאים Ringers חומץ. עדינות להתסיס diaphragm בצלחת על מנת לשטוף את הדם. רענן אצבעות פתרון לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך פס קטן של הסרעפת מהגיד המרכזי לצלעות לאורך הכיוון של הסיבים בחלק המרכזי של hemidiaphragms לרוחב. הרצועה צריכה להיות בין 2-4 מ&quot;מ רחב. בעזרת מספרי עצמות, לחתוך את הצלעות משני הצדדים של הרצועה, ומשאיר כ 1-2 סככת מ&quot;מ של צלעות בכל צד של רצועת הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את התפרים בגיד המרכזי. לקשור את תפר לכל אחד מקצות הצלעות רוחביות הבולטים, ואז לקשור אותם יחד כדי להפוך את לולאה גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי רצועות ניתן להשיג מכל סרעפת נתונה (אחד מכל צד). </li></ol> 3. שרירי הרכבה בבאת&#39; המכניקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את התפרים ולהשתמש אלה כדי לצרף שרירים להודעה נוקשה בקצה אחד, ולמתמר כוח בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את האורך כדי לוודא את השריר הוא לא רפוי, אבל לא מתוח. קירוב טוב הוא musc המנוחהאורך le כמו ב1.4-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה צריכה להיות מלאה בפתרון Ringers חומץ נשמר ב22 ° C כדי להאריך את שרירי יציבות לבדיקה. שרירים צריכים לנוח למשך 5 דקות באמבטיה זה לפני המבחן פונקציונלי, כך שטמפרטורת השריר היא מתאזנת עד 22 ° C. </li></ol> 4. התכווצויות איזומטרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע תנאי גירוי Supramaximal. לאחר שריר ממוקם באמבטיה, השתמש 0.5 פולסים msec גירוי בודדים כדי לייצר עווית, ולפקח על תפוקת כוח. הגדל בהדרגה את הזרם עד שהכח משיג רמה מקסימלי אך יציבה. הגדל נוכחי עד 10% יותר מרמה זו לניסויים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים אורך אופטימלי. באמצעות גירויים מפרכס איזומטרי, להתאים את האורך של השריר בהדרגה עד לכוח מקסימאלי מתקבל. הנח את השרירים ~ 10 שניות בין כל כיווץ. אורך שריר אופטימלי (L o) מושגת כאשר כוח העווית הוא מקסימאלי. אורך שריר רשום (האורך יהיהtween צומת myotendinous לאד, ובין צומת המרכזי גיד myotendinous והחדרת השריר לצלעות) באמצעות מחוגה Vernier. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיל Tetanic איזומטרי מרבי. לעורר שרירים להגדיר בL o לתקופה של 500 אלפיות שני, עם סדרה של פולסים 0.5 msec בגירוי supramaximal ובתדר היתוך (מהרמה של יחסי כוח תדר (למשל Ref:. 8) הרמה לשרירי אד היא הושג בדרך כלל עם 120 הרץ, ולשרירי סרעפת עם 100 הרץ. להמריץ 3 פעמים בתדירות המתאימה עם תקופות מנוחה של 5 דקות בין התקפי גירוי לכל שריר. </li></ol> 5. התכווצויות אקסצנטריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שרירים לנוח 5 דקות בין ביצוע התכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את השרירים באופן שווה ל80 הרץ הראשוני 500 אלפית השני, ואחריו 10% מתיחת L o בגירוי msec הסופי 200 (שיעור מתיחה של 0.5 הליטר o/ שני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על דפוס גירוי עם 5 דקות בין הפסקות למספר הרצוי של התכווצויות אקסצנטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד כוח לכל התכווצות בפרק הזמן שלפני המתיחה. לחשב את הירידה בכוח בין הציר הראשון והאחרון. </li></ol> 6. הסרת שריר מהמנגנון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצר את אורך השריר, כדי לאפשר הסרה עדינה של השריר מהמתמר ולפרסם ולהחזיר אותו לצלחת לנתח באצבעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תפרים מהשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשרירי אדי, למחוק את השריר פעמים, שוקל אותו, לפני עיבוד לאחר מכן (למשל הקפאה, תיקון, וכו &#39;). זה יהיה חשוב לחישוב שטח חתך צלב, וכוח מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשריר הסרעפת, להשרות ב0.1% procion כתום, צבע impermeant קרום לדקות 15-20. זה יספק מדד לניזק לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את השרירים מההכנסה הגרמית, כמו גם את הסנאטגיד RAL. זה הכרחי כדי לספק משקל מדויק של השריר. תמחה כאמור לפני השקילה והכנה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב לחצות איזור Sectional (CSA): CSA (מ&quot;מ 2) = מסה (מ&quot;ג) / [(L o מ&quot;מ) * (L / L O) * (1.06 / מ&quot;מ מ&quot;ג 3)], בי L / L o הוא הסיבים ליחס אורך שריר (0.45 עבור אד, 1.0 לסרעפת) 5 ב -1.06 הן הצפיפות של שריר. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות אורורה מדעית.

המטרה של מאמר זה היא לספק הדרכה לביצוע תפקוד שרירים מבודד בשני שרירים מעכברים - edl והסרעפת. הערכה של שרירים אלה יכול לספק תובנה אם צנרת תרופות למחלת שרירים מועילות. לשני שרירים, הגורם המרכזי בקבלת נתונים חזקים הוא נתיחה נקיה. לכן, תרגול ושכלול צעד הבידוד הראשוני חיוני לפני שעבר על בדיקות פונקציונליות. בנוסף, הקמת אמות מידה פונקציונליות לשרירים נורמלים היא קריטית לפני ביצוע השוואות לשרירי dystrophic, או בין טיפולים. זה יבטיח כי תוצאות המחקר אינן כפופות להשתנות גבוהה שהקנתה את היכולת של האדם שבצע את הניסויים. השימוש בצבע impermeant קרום יכול לעזור בביצוע אופטימיזציה להכנת הנתיחה, לדגירה של כל שריר בתמיסה המכילה צבע כזה יציין סיבים פגומים ביותר, ויכול לשמש כמדד דהצלחת issection. צמצום מספרם של סיבי השריר שהניזוק ביעזור לייעל את המדידה. את הסיבים שניזוקו על ידי נתיחה לזרוח הרבה יותר בהירים מאלה נפגעו על ידי כיווץ אקסצנטרי, ולכן אם לצבוע הוא גם משמש בתהליך המכניקה, אפשר להשתמש בעוצמת הצבע כדי להבחין בין שני סוגים של ניזק. נתיחה של רצועות סרעפת כמעט תמיד יש ניזק סיבים, פשוט כי על ידי החיתוך לאורך הסיבים, חלק בלתי נמנע לקבל נהרס. ספיגת דאי היא חזקה בסיבים הפגומים האלה, ואלה בדרך כלל מוגבלים לשולים החיצוניים של ההכנה. בממוצע, אנו רואים להקה של סיבים שהניזוק שהם ~ 3 סיבים ברוחב (~ 120 מיקרומטר) משני צדי רצועת השריר. אם הלהקה הפגומה מונה יותר מ 15% של השרירים, אז הנתונים נמחקים. הכנת הסרעפת יש גם מגבלות על הגודל אופטימלי לפעולות פונקציונליות. אנחנו גילינו שחתיכות של דiaphragm שהם רחבים יותר מ 5 מ&quot;מ מתחיל לקפל בעצמם, כי עניבת הגיד המרכזית היא רק בנקודה אחת. התוצאה הוא הירידה בכוח מסוים בהכנה. גם אנחנו גילינו שרצועות צרות יותר יש גם כוח סגולי נמוך, אשר אנו מאמינים היא כי המספרים של סיבים שניזוקו במהלך הנתיחה מהווים חלק גדול יותר ממספר הסיבים הכוללים. לדוגמה, אם 0.1 מ&quot;מ בכל צד פגום, שעומד על 5% (2x0.1 מ&quot;מ / 4 רצועת מ&quot;מ) של הכנת השרירים שאינו תורמים לכוח, בעוד שאם הרצועה היא רק 1 מ&quot;מ, ולאחר מכן 20 % מהכנת השריר פגומים. לפיכך, גם את רוחבו של האזור הפגוע, כמו גם הרוחב של כל ההכנות הם גורמים חשובים כדי לשלוט. מדידות של מתח איזומטרי מרבי מחייבות שכל סיבי השריר בשריר המגורה. מכיוון שקיימות שונות עצומות ברכיבים של מנגנון לתפקד, זה צריך להיקבע לכל קבוצת פרטעד. לדוגמה, גודל אמבטיה או הסוג של גירוי יכול להשפיע על עוצמת הגירוי. גירוי עווית הוא דרך סבירה כדי לקבוע תנאי גירוי supramaximal. ברגע שזה הוקם להתקנה ושרירים ספציפיים, זה יכול להיות מנוצל עבור מחקרים עוקבים. לעומת זאת, האורך האופטימלי של כל שריר נתון צריך להימדד עבור כל הכנה באמצעות תהליך איטרטיבי שתואר לעיל. הדבר זה מבטיח שחפיפת נימה עבה ודקה היא אופטימלית וכושר הייצור הפוטנציאלי המקסימאלי כוח נמדד. הליכים חלופיים יכולים להסתמך על דפוסי התאבכות הקשורים לפסי השרירים, אבל זה דורש ציוד נוסף שלא תאר כאן. אנו משתמשים באופן שגרתי 500 משכי גירויי msec, אשר נופלים בטווח ביניים של פרמטר זה בשימוש על ידי חוקרים אחרים בתחום זה. למרות שזה עלול לגרום לעייפות מסוימת של השריר במהלך ההתכווצות, אשר באו לידי ביטויעל ידי &quot;סאג&quot; בהפקת הכח המרבית, זה בעצמו יכול להיות אינפורמטיבי. לדוגמה, הבדל בעייפות יכול להיות מושגת על ידי סוגים שונים של טיפולים כוללים אלה שטיפול סיד היעד, ומכאן לשקוע בתוקף במהלך ההתכווצות פעילה יכול לשמש כמדד לשיפור. לחלופין, אובדן הכח יכול להצביע על כך שהתפרים בגידים הם לא מספיק חזקים, ושהם החליקו במהלך ההתכווצות. השרירים יש להסיר מן האמבטיה והתפרים יש קשר באם זה קורה. אנו משתמשים גם בסדרה של 3 התכווצויות tetanic, שעוזרת להעריך את היציבות של ההכנה. שוב, תלושי תפר יובילו לאובדן של כוח בין צירים, הדורשים תפירה מחדש קשירה-. שרירים גדולים יכולים גם לייצר ליבות anoxic, שיוביל להפסדים בכח בפרוטוקול. גודל שריר הוא גורם מגביל לביצוע בדיקות תפקוד שרירים מבודדות, שבו שרירי אד עם מסה גדולה מ 20 מ&quot;ג מאבדים כוח עם כל Contraction, ולא יכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. רצועות סרעפת לא סובלות מאותם סיבוכים כי הם דקים מספיק כדי להיות כדאיות ממושכת באמבטיה. שרירים אחרים יכולים להיות מנוצלים לתפקוד שרירים מבודד, לרבות שריר soleus, המשמש בדרך כלל, אבל לא תארו כאן. רבים מאותם הנהלים יכולים להיות מאומצים על soleus במונחים של ההכנה והבדיקה הפונקציונלית. עם זאת, ההבדלים העיקריים הם בתדר הגירוי, ואת הפרמטרים להתכווצויות אקסצנטריות. השתמש של soleus לפונקציה שמשלים את שני שרירים האחרים, ולכן הוא צריך להיחשב כחלק מחבילה &quot;סטנדרטית&quot; להערכת עכברי dystrophic 4, 7. כיווץ אקסצנטרי מספק מדד השבריריות התכווצות, וזה חשוב להשתמש בפרוטוקול שגורם לאובדן צנוע של כוח בשרירים מחי wildtype ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic לא טופלו, כך שיש טווח דינמי רחב להשוואות. חוסר כל אובדן כוח בשרירים נורמלים מרמז כי הכיווץ האקסצנטרי הוא קל מדי, ולא יהיה מספיק כדי להבחין בין טיפולים שאינם יעילים ואת אלו שהם באמת מועילים. עם זאת, הפסד דרמטי בכוח בשרירים נורמלים הנתון לכיווץ אקסצנטרי עלול להיות גדול מדי כדי להקניט את הבדלים הקשורים במחלה. הפרוטוקול שלנו לedl והסרעפת משתמש בשיעור 0.5 Lo / שנייה למתוח כדי לייצר 10% שינוי אורך. אנחנו בדרך כלל לבצע 5 התכווצויות אקסצנטריות, שתוצאה בהפסד קטן של כוח בשרירים נורמלים ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic. אין ספק, כל הפרמטרים הללו יכול להיות מגוונים כדי להגדיל את אורך השינוי הכולל, בשיעור של מתיחה, או במספר ההתכווצויות אקסצנטריות כדי להבחין בהבדלים בין שריר חולה ובריא, כמו גם על השפעת סוג מסוים של מוטציה או לאreatment אחד לא לומד. כל עוד יש הבדל ניכר בין שרירים בריאים וחולים, אז יש תקן זהב להגיע למונחים של טיפולים. לסיכום, פרוטוקול זה מקובע הנחיות לביצוע התכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, ואני מקווה שמזהה את המלכודות הפוטנציאליות להימנע בעת הגדרת טכניקה זו במעבדה שלך.

מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכת טיפולים פוטנציאליים לשרירי פתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. למחלת שרירים, השימוש במודלים של עכברים הפך למרכיב מרכזי להבנת הקשר בין גנוטיפ ופנוטיפ, ולהעמקת ידע שלתכנון והבדיקה של תרופות פוטנציאליות. את ניוון השרירים, בפרט, יש לסמוך על עכברים כדי להעריך הסוכנים הללו וליצור נתונים טרום קליניים הנדרשים להתקדם לניסויים בחולים. מדד תוצאה תכופה משתמש בתפקוד שרירים מבודדים כדי לקבוע כוח, אשר חל על מגוון רחב של מחקרים. מדד נוסף הוא השימוש באקסצנטרי, או התארכות, התכווצויות לקבוע שינויים בשלמות קרום שריר, שהוא לוקה במחלת ניוון שרירים דושנה, ומודל עכברי למחלה זו (MDX). לכן, זה הכרחי עבור אלו סוגים של measuremמציג להיות רגיש לשחזור. Longus עכבר extensor digitorum (אדי) השריר כבר בשימוש נרחב לתפקוד שרירים מבודד בשל הגיאומטריה שלו אידיאלית והגודל, כולל נטייה אחידה סיבים וגידים מוחלטים 2, 5, 6, 10, 12. שיטות לשרירי אדי מדידות פונקציונליות איזומטרי תוארו בפרסום קודם יופיטר 8, כמו גם ב1 SOP טריט-NMD. הרחבנו את התיאור של שיטות אלה כדי לכלול את שני צירים איזומטרי ואקסצנטריים. סימני היכר של מחלה ניכרים באד, לרבות מחזורי heighted של ניוון / התחדשות ותפוקת כוח מצומצמת. סרעפת העכבר מציגה את ההתקדמות פתולוגית המהירה ביותר של ניוון שרירים בהשוואה לשרירים אחרים בעכבר 11. בגיל 6 חודשים, סיסטיק המצטבר מהווה כ 50% מהשריר. כתוצאה מכך באופן משמעותי impaireפלט ד כוח 11. לכן, סוכנים טיפוליים שיכול למנוע חדירת fibrotic ניתן להעריך ביעילות בסרעפת. אובדן הדיסטרופין בשריר גורם לשבירות מוגברת וניזק מוגבר בכל התכווצות השרירים 9. לכן טיפולים רבים למחלת ניוון שרירים דושן מיועדים להחלפת הדיסטרופין. ככזה, assay שהפך חיונית להערכת אסטרטגיות אלה הוא כיווץ אקסצנטרי, שיכול להבחין בין השרירים נורמלים וdystrophic, כמו גם לקבוע מה התועלת באסטרטגיה מסוימת יש להגנה על שריר dystrophic מניזק כויץ 2, 3, 4, 12. הליך זה מחייב גם סרוו מנוע כפול במצב שיכול להשפיע על אורך / ושיא כוח, או בשיטה של ​​התאמת אורך מהירות נפרד ממתמר כוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> בבדיקת מערכת שריר מבחנה </td><td> אורורה מדעית </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> ליקה </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> מקור אור ACE </td><td> שוט-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים זווית </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> ידית אזמל </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10003-12 </td><td> כלי לנתח חלופי </td></tr><tr><td> להבים מעוגלים אזמל # 12 </td><td> מדע פייןכלי עבודה </td><td> 10012-00 </td><td> כלי לנתח חלופי </td></tr><tr><td> מספרי עצם </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T תפר קשירת מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> דומון מלקחי אס - זוויתי </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> גודל תפר משי קלוע 6-0 </td><td> Teleflex רפואי </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> קלטת רפואית </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> קטמין הידרוכלוריד 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> מינון סופי הוא 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג </td></tr><tr><td> הזרקת TranquiVed (xylazine 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> מינון סופי הוא 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג </td></tr><tr><td> ריאקטיבי כתום 14 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> אצבעות מרכיבי פתרון </td><td></td><td></td><td> פתרון הוא גז מתאזן עם 95% O 2 ו 5% CO 2, PH סופי 7.4 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S7653 </td><td> ריכוז סופי: 118 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> P217-3 </td><td> ריכוז סופי: 4.7 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> dihydrate סידן כלוריד </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> C79-500 </td><td> ריכוז סופי: 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אשלגן זרח monobasic </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> P-285 </td><td> ריכוז סופי: 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> JT בייקר </td><td> 2500-01 </td><td> ריכוז סופי: 0.57 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) הצינורrazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP310-500 </td><td> ריכוז סופי: 5.95 גר &#39;/ ל&#39; </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G8270 </td><td> ריכוז סופי: 5.5 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

קריטי להערכה של תרופות פוטנציאליות למחלת שרירים הם הערכות פיסיולוגיות רגישות ולשעתק של תפקוד שרירים. בגלל ניסויים טרום קליניים רבים מסתמכים על מודלי עכבר למחלות אלה, תפקוד שרירים מבודד הפך לאחד את הסטנדרטים להחלטות Go / NoGo בהעברת סמי מועמדים קדימה לחולים. נדגים הכנת longus extensor digitorum (אדי) ושרירי סרעפת לבדיקות פונקציונליות, שהם השרירים הבולטים מנוצלים ללימודים אלה. גיאומטרית שריר האד היא אידיאלית להכנות שרירים מבודדות, עם שני גידים נגיש בקלות, וגודל קטן שיכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. הסרעפת מציגה הפתולוגיה מתקדמת עמוקה בחי dystrophic, ויכולה לשמש כפלטפורמה להערכת טיפולים פוטנציאליים רבים מאבק בסיסטיק, וקידום יציבות myofiber. פרוטוקולים לבדיקה שגרתית, כולל איזומטרי וeccenהתכווצויות tric, יוצגו. כוח איזומטרי מספק הערכה של כוח, והתכווצויות אקסצנטריות לעזור להעריך יציבות sarcolemma, ששבשה בסוגים רבים של ניוון שרירים. השוואות של התוצאות הצפויות בין שרירים משרירי wildtype וdystrophic גם תהיינה מסופקת. אמצעים אלה יכולים להשלים מדידות מורפולוגיות וביוכימיים של הומאוסטזיס רקמות, כמו גם הערכות של בעלי חיים שלמות של תפקוד שרירים.

ערכים צפויים לכוחות איזומטרי של שרירי edl מ 12 בעלי חיים בשבוע ישנים שמוצגים באיור 1. משום ששרירים של MDX מפגינים גידול יתר, כוח tetanic סך הכל יכול להיות גבוה יותר בהשוואה לשריר MDX גיל פקדי wildtype מתאימים. עם זאת, מדד מתאים יותר מתפוקה הפונקציונלית הוא כוח ספציפי (איור 2), שבו כוח מנורמל לשטח חתך כדי לחשב את הערך הזה. כוח ספציפי תלוי ביכולת העצמית התפקודית של השרירים, שבו החולשה בשרירי dystrophic היא ברורה יותר כשהן בכוח מוחלט ושטח חתך צלב מטופלות. בידות שלנו, שרירי edl מ עכברי MDX להפיק כ 20 - כוחות ייחודיים 25% נמוכים יותר מאלה של גיל המתאימים עכברי wildtype 10-26 שבועות של גיל. לסרעפת, כוח ספציפי רק הוא רלוונטי להשוואות, כי ההכנה היא פיסה של השריר תלויה dissection. השוואה של כוח ספציפי בין שרירי סרעפת MDX wildtype ומשקפת את הפתולוגיה המתקדמת ברקמה זו. תפוקת הכח איזומטרי פוחתת עם גיל (איור 3), כך שעד הגיל 6 חודשים, שרירי סרעפת מעכברי MDX לייצר לא יותר מחצי מהתפוקה התפקודית של רצועות סרעפת מגיל מתאים פקדי wildtype. דוגמה להתכווצויות אקסצנטריות מבדיקות סרעפת מוצגת באיור 4. עם כל כיווץ אקסצנטרי שלאחר מכן, תפוקת כוח פוחתת ברצועות סרעפת משני wildtype (עכברי C57) ועכברי MDX. עם זאת, אובדן הכח הוא דרמטי יותר בדגימות שריר מעכבר MDX, ככל הנראה מהעדר הדיסטרופין והחלבונים הקשורים אליו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> איור 1. כוח tetanic איזומטרי בwildtype ו f שרירי אדי MDX<html> 12 עכברים זקנים בשבוע ROM. כוח מוחלט יכול להיות גבוה יותר בשרירי הגיל מתאים-MDX אד בשל גידול יתר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> איור 2. כוח tetanic איזומטרי נירמול של אזור חתך צלב שרירים הוא כוח סגולי, ומגלה יכולת תפקודית של שרירי אדי מדוכא מעכברי MDX בהשוואה לאלו של עכברי wildtype. עקבות הן מאותם עכברים כמו באיור 1. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> איור 3. האובדן ההדרגתי של יכולת יצירת כוח מוערך על ידי כוח מסוים הוא בולט ביותר בסרעפת של עכברי MDX (קווים אדומים) בהשוואה לwildtype (עכברי C57 בקו כחול). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. אובדן הכח כפונקציה של מספר כיווץ אקסצנטרי לשרירי סרעפת מ 12 שבוע ישן עכברים C57 ועכברי MDX. נתוני ממוצע ± SEM עבור N = 4 שרירים לגנוטיפ.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכה של השרירים רפויים פוטנציאלי לפתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. נדגים הכנת longus extensor digitorum שרירי סרעפת ובדיקה פונקציונלית. יוצגו פרוטוקולים להתכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, כמו גם הבדלים בתוצאות בין שרירי dystrophic, המייצגים מצב פתולוגי, ושרירי wildtype.

הערכת דור חיל איזומטרי והאקסצנטרית של שרירי שלד מבודד ממודלים עכבריים של ניוון שרירים

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...