Name: isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Alla förfaranden har granskats och godkänts av University of Pennsylvania IACUC. 1. EDL dissekering och beredning (ca 30 min) <ol><li> Söva möss för att säkerställa att de upplever någon smärta eller ångest under förfarandet, men att musklerna förblir väl syresatt med cirkulationen. Vi använder rutinmässigt en ketamin / xylazin cocktail (100/10 mg / kg) injicerades via IP. Kirurgisk plan av anestesi bestäms av total avsaknad av pedal eller palpedral reflexer indragning eller brist på örat rycka svar. </li><li> Immobilisera bakbenen med medicinsk tejp, och ta bort huden på nedre främre bakben att exponera muskler i detta område. Hålla musklerna fuktiga med tillämpningen av PBS med jämna mellanrum. </li><li> Enligt en dissektionsmikroskop, göra ett litet snitt i sidled till knäet i syfte att exponera den proximala senan av EDL muskeln. Det finns två senor i denna region, och båda bör skäras så att reborttagande av EDL. </li><li> Vid den mediala fotleden, skär senan av TA muskler att exponera de distala senor i EDL, som sträcker sig längs meta tarsals. Lyft TA muskeln ur vägen, var noga med att inte skära eller vidrör EDL under. Återgå till de distala senor i EDL, klippa var och en och dra dem genom ankeln och sedan greppa senor, försiktigt dra EDL från resten av benet. Det bör släppa från den proximala änden fritt, men om inte, gå tillbaka till den laterala snitt för att säkerställa att senan skärs. Ta bort muskeln och placera det i en dissekera maträtt fylld med kylda syresatta ringsignaler. Nåla muskeln genom senorna vid ungefär vilande längd, vilket är längden påträffats in vivo. Längden är för kort när muskeln är slapp i skålen, och alltför lång tid om muskeln drar på dissekera stiften. </li><li> Euthanize musen omedelbart efter muskel avlägsnas genom cervikal dislokation. </li><li> Knyt suturer till tioDons, så nära som möjligt till muskeln, men inte röra muskeln. Nåla fast muskeln cirka vilar längd med hjälp av suturer. </li></ol> 2. Membran dissekering och beredning (ca 30 min) <ol><li> Euthanize mössen före detta förfarande genom cervikal dislokation under anestesi, om samma mus utsattes för båda dissektioner, eller av CO 2 följt av bekräftelse med cervikal dislokation. </li><li> Göra ett snitt i huden för att exponera buken och brösthålan. Öppna bukhålan, och skär kroppen väggen precis nedanför revbenen. Använda ben sax, och börjar ovanför membranet insättning, klippning runt hela bröstkorgen längs med revbenen, och skär genom ryggraden. Skär blodkärl löper genom centrum av membranet, så att membranet kan avlägsnas lätt. </li><li> Ta bort membranet från musen, och lägg i en dissekera maträtt fylld med syresatta ringsignaler. Skaka försiktigt på DIAPhragm i skålen att tvätta bort blod. Refresh Ringers lösning vid behov. </li><li> Klipp en liten remsa av membranet från den centrala senan till ribborna längs orienteringen av fibrerna i den centrala delen av de laterala hemidiaphragms. Remsan bör vara mellan 2-4 mm bred. Använda ben sax, klippa resåren på vardera sidan av bandet, vilket ungefär 1-2 mm överhäng av resår på vardera sidan av membranet remsan. </li><li> Knyt suturer till den centrala senan. Knyt sutur till varje sidled utskjutande revben ändar, och sedan knyta ihop dessa för att göra en stor ögla. </li><li> Två remsor kan erhållas från en given membran (en från varje sida). </li></ol> 3. Montering Musklerna i mekanik Bath <ol><li> Tag i suturer och använd dessa för att fästa muskeln till en styv inlägg i ena änden, och till en kraftomvandlare i andra änden. </li><li> Justera längden för att säkerställa att muskeln inte är slak, men är inte spänd. En god approximation är den vilande Muscle längd som i 1,4 till 1,5. </li><li> Badet bör fyllas med oxygenerad Ringers lösning hölls vid 22 ° C för att förlänga muskel stabilitet för testning. Muskler ska vila i 5 min i badet innan funktionsprovning så att musklerna temperatur är i jämvikt till 22 ° C. </li></ol> 4. Isometriska kontraktioner <ol><li> Upprätta supramaximal stimulering Villkor. Efter en muskel placeras i badet, använda enkla 0,5 ms stimuleringspulser att generera en ryckning, och övervaka kraften ut. Gradvis öka strömmen tills kraften når en maximal men stadig nivå. Öka strömmen till 10% mer än denna nivå för de återstående experimenten. </li><li> Upprätta optimal längd. Använda isometriska rycka stimuli, justera längden på muskeln gradvis tills en maximal kraft uppnås. Vila muskeln ~ 10 sekunder mellan varje sammandragning. Optimal muskel längd (L o) uppnås när rycka kraft är maximal. Registrering muskel längd (längden varalan de myotendinous korsningar för EDL, och mellan den centrala senan myotendinous korsning och muskeln införandet till ribban) med Vernier skjutmått. </li><li> Maximal Isometrisk tetanic Force. Stimulera muskler inställd på Lo för en period av 500 millisekunder, med en serie av 0,5 ms pulser vid supramaximal stimulering och vid fusion frekvens (från platån av frekvens-kraften förhållande (t.ex. Ref: 8). Platån för EDL muskler är vanligtvis uppnås med 120 Hz, och för membran muskler med 100 Hz. Stimulera 3 gånger på respektive frekvens med viloperioder av 5 min mellan stimulering anfall för varje muskel. </li></ol> 5. Excentriska Sammandragningar <ol><li> Tillåt muskler att vila 5 min mellan utföra isometriska och excentriska sammandragningar. </li><li> Stimulera muskler vid 80 Hz isometriskt för den första 500 ms, följt av en 10% L o sträckning i den slutliga 200 ms stimulering (en sträcka av 0,5 L o/ Sek). </li><li> Upprepa stimulering mönster med 5 min vila mellan för önskat antal excentriska sammandragningar. </li><li> Mät kraft för varje sammandragning under tidsperioden före sträckan. Beräkna nedgången i kraft mellan första och sista sammandragning. </li></ol> 6. Muskel Borttagning från apparaten <ol><li> Korta muskeln längd för att möjliggöra skonsam borttagning av muskler från givaren och skicka och returnera den till en dissekera skålen med ringsignaler. </li><li> Ta suturer från musklerna. </li><li> För EDL muskler, blot muskeln två gånger och sedan väga den, innan efterföljande behandling (t.ex. frysning, fastställande, etc). Detta kommer att vara viktigt för att beräkna tvärsnittsarean, och specifik kraft. </li><li> För diafragman, blöt i 0,1% Procion apelsin, ett membran ogenomträngligt färgämne för 15-20 min. Detta kommer att ge ett index på dissektion skador. </li><li> Dissekera muskeln bort från beniga insättning, liksom procentral sena. Detta är nödvändigt för att ge en exakt vikt av muskeln. Blot enligt ovan före vägning och efterföljande beredning. </li><li> Beräkna tvärsnittsarean (CSA): CSA (mm 2) = massa (mg) / [(Lo mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], där L / L o är fibern till muskel längdförhållande (0,45 för EDL, 1,0 för membranet) 5 och 1,06 är tätheten av muskeln. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Aurora Scientific.

Målet med denna artikel är att ge vägledning för att utföra isolerad muskel funktion på två muskler från möss - EDL och membranet. Utvärdering av dessa muskler kan ge insikt om huruvida eller inte terapeutiska kandidater för muskelsjukdom är bra. För båda musklerna, är den viktigaste faktorn för att få säkra uppgifter en ren dissektion. Därför tränar och finslipa den ursprungliga isoleringen steget är viktigt innan du flyttar till funktionell testning. Dessutom fastställande funktionella riktmärken för normal muskel är avgörande innan du köper jämförelser dystrofisk muskel eller mellan behandlingarna. Detta kommer att försäkra att resultaten från studien är inte föremål för hög variabilitet förlänas genom förmågan hos den som utför experimenten. Användningen av ett membran ogenomträngligt färgämne kan hjälpa till med att optimera dissektion förberedelse, för inkubering av varje muskel i en lösning innehållande ett sådant färgämne kommer att markera mest skadade fibrer, och kan tjäna som ett index av dissection framgång. Minimera antalet fibrer skadade i muskeln kommer att bidra till att optimera mätningen. De fibrer som skadats av dissektion fluorescerar mycket starkare än de som skadats av excentrisk sammandragning, och så om färgämnet används också under processen mekanik, kan man använda intensiteten av färgämnet att skilja mellan de två typerna av skador. Dissektion av membran band kommer nästan alltid fiberskada, helt enkelt eftersom genom att skära längs fibrerna, oundvikligen några få förstöras. Färgämnesupptagning är stark i de skadade fibrer, och dessa är normalt begränsade till de yttre kanterna av preparatet. I genomsnitt, observerar vi ett band av skadade fibrer som är ~ 3 fibrer i bredd (~ 120 | im) på vardera sidan om muskeln remsan. Om det skadade bandet innefattar mer än 15% av muskeln, då data tas bort. Membranet beredningen har också begränsningar för optimal storlek för funktionella åtgärder. Vi har funnit att bitar av diaphragm som är bredare än 5 mm börjar vika upp sig, eftersom den centrala senan slips är bara på en punkt. Detta resulterar i minskad specifik kraft i beredningen. Vi har också funnit att smalare band också har lägre specifik kraft, som vi tror beror på att antalet fibrer som skadats under dissektion omfattar en större andel av det totala fiberinnehållet nummer. Till exempel, om 0,1 mm på varje sida är skadad, så är 5% (2x0.1 mm / 4 mm remsa) av muskeln preparatet som inte bidrar att tvinga, medan om remsan är endast 1 mm, sedan 20 % av muskeln beredningen är skadad. Sålunda, både bredden av den skadade regionen samt bredden av hela beredningen är viktiga faktorer för att kontrollera. Mätningar av maximal isometrisk spänning kräver att alla muskelfibrer i en muskel stimuleras. Eftersom det är en enorm variation i komponenterna i en funktion apparat måste detta fastställas för varje enskild uppsättningupp. Till exempel, kan bad storlek eller typ av stimulatorn påverka stimuleringens intensitet. Twitch stimulering är ett rimligt sätt att avgöra supramaximal stimulering förhållanden. När detta har bildats för en specifik inställning och muskler, kan den användas för efterföljande studier. I motsats, måste den optimala längden av en given muskler som skall mätas för varje beredning med användning av iterativ process som beskrivits ovan. Detta säkerställer att tjocka och tunna filament överlappning är optimal och den maximala potentiella kraften produktionskapacitet mäts. Alternativa förfaranden kan lita på diffraktionsmönster associerade med muskel strimmor, men detta kräver ytterligare utrustning som inte beskrivs här. Vi använder rutinmässigt 500 msek stimulering löptider, som infaller i mellanregistret av denna parameter som används av andra forskare inom detta område. Även om detta kan medföra en viss trötthet i muskeln under kontraktion, vilket är uppenbartav en &quot;sag&quot; i den maximala kraften produktionen kan detta i sig vara informativ. Till exempel skulle en skillnad i utmattning uppnås genom olika typer av behandlingar inklusive sådana som mål kalcium hantering därav sag i kraft under aktiv kontraktion kan fungera som ett index för förbättring. Alternativt kan förlusten av kraften indikerar att suturerna på senor är inte tillräckligt stram, och att de glider under kontraktion. Muskeln måste avlägsnas från badet och suturerna måste återupprättas bunden om detta inträffar. Vi använder också en serie av 3 tetanic sammandragningar, vilket hjälper till att utvärdera stabiliteten hos preparatet. Återigen skulle sutur glider leda till förlust av kraft mellan värkarna, kräver sutur nytt kopplingsförbehåll. Stora muskler kan också generera anoxiska kärnor, vilket leder till förlust av kraft under protokollet. Muskelmassa är en begränsande faktor för att utföra isolerad testning muskelfunktion, där EDL muskler med massor större än 20 mg förlorar kraft med varje entreprenörning, och kan inte stödjas av superfusion i ett bad. Membran band lider inte av samma komplikationer eftersom de är tunna nog att ha långvarig lönsamhet i badet. Andra muskler kan användas för isolerad muskelfunktion, inklusive soleusmuskel, som vanligtvis används, men inte beskrivs här. Många av samma förfarande kan antas för soleus i fråga om förberedelser och funktionella tester. De största skillnaderna finns i stimulans frekvens och parametrar för excentriska sammandragningar. Användning av soleus för funktion kompletterar de andra två muskler, och det bör betraktas som en del av ett &quot;standardpaket&quot; för att utvärdera dystrofa möss 4, 7. Excentrisk kontraktion ger ett index på kontraktila bräcklighet, och det är viktigt att använda ett protokoll som resulterar i måttlig förlust av kraft i musklerna från vildtyp djur och en betydande förlust av kraftobehandlade dystrofa muskler så att det finns ett brett dynamiskt omfång för jämförelser. Brist på någon kraft förlust i normala muskler tyder på att den excentriska sammandragning är alltför milt, och kommer inte vara tillräcklig för att skilja mellan behandlingar som inte är effektiva och de som verkligen är till nytta. Emellertid kan en dramatisk förlust av kraft i normala muskler utsätts för excentrisk kontraktion vara för stor för att retas ut skillnader i samband med sjukdomen. Vår protokoll för EDL och membranet använder en 0,5 Lo / sek sträckningshastighet att producera en 10% längd förändras. Vi utför vanligtvis 5 excentriska sammandragningar, vilket resulterar i en mindre förlust av kraft i normala muskler och en betydande förlust av kraft i dystrofa muskler. Visst kan alla dessa parametrar varieras för att öka den totala längden ändras, graden av sträckning, eller antalet excentriska kontraktioner för att skilja skillnader mellan sjuka och friska muskler samt om effekterna av en viss typ av mutation eller treatment en studerar. Så länge det finns en markant skillnad mellan normala och sjuka muskler, så finns det en guldmyntfot att nå för i form av behandlingar. Sammanfattningsvis fastställer detta protokoll riktlinjer för att utföra isometriska och excentriska kontraktioner, och förhoppningsvis identifierar potentiella fallgropar att undvika när du denna teknik i din labb.

Muskelfunktion mätningar bidrar till utvärderingen av potentiella behandlingar för muskel patologi, samt fastställande av mekanismerna bakom fysiologi denna vävnad. För muskelsjukdom, har användningen av musmodeller blivit en central del för att förstå sambandet mellan genotyp och fenotyp, och för att utvidga den kunskapen i konstruktion och provning av potentiella läkemedel. De muskeldystrofi, i synnerhet, har förlitat sig på möss för att utvärdera dessa medel och etablera prekliniska data som krävs för att gå vidare till studier på patienter. Ett vanligt resultatmått använder isolerad muskelfunktion att bestämma styrka, som är tillämplig på ett brett spektrum av studier. En annan åtgärd är att använda excentriska, eller förlängning, för sammandragningar bestämma förändringar i muskel-membran integritet, vilket är bristfällig i Duchennes muskeldystrofi och mus modell för denna sjukdom (mdx). Därför är det viktigt att dessa typer av measuremföräldrar att vara lyhörda och reproducerbar. Musen extensor digitorum longus (EDL) muskel har använts i stor utsträckning för isolerad muskelfunktion grund av dess ideal geometri och storlek, inklusive enhetlig fiberorientering och definitiva senor 2, 5, 6, 10, 12. Metoder för EDL muskler isometriska funktionella mätningar har beskrivits i en tidigare JUPITER publikation 8, liksom i behand-NMD SOP 1. Vi har utvidgat beskrivningen av dessa metoder för att inkludera både isometriska och excentriska sammandragningar. Kännetecken av sjukdomen är tydliga i EDL, inklusive heighted cykler av degenerering / regenerering och minskad kraft utgång. Musen membran uppvisar den snabbaste patologiska utvecklingen av muskeldystrofi jämfört med andra muskler i musen 11. Genom 6 månaders ålder, omfattar kumulativ fibros ca 50% av muskeln. Detta resulterar i väsentligt impaired kraften ut 11. Därför kan terapeutiska medel som kan förhindra fibrotisk infiltrering utvärderas effektivt i membranet. Förlusten av dystrofin i muskeln leder till ökad instabilitet och ökad kontraktila skador i alla muskler 9. Därför många behandlingar för Duchennes muskeldystrofi är inriktade för dystrofin ersättning. Som sådan är en analys som har blivit avgörande för att bedöma dessa strategier excentrisk kontraktion, vilket kan skilja mellan normal och dystrofisk muskler samt avgöra vad nytta en viss strategi har för att skydda en dystrofisk muskel från kontraktila skada 2, 3, 4, 12. Denna procedur kräver antingen en bimodal servomotor som kan modulera / postlängd och kraft, eller en metod för justering längd snabbt separat från en kraftomvandlare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> in vitro-Muscle testsystem </td><td> Aurora Scientific </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE ljuskälla </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Dissekera sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Vinklade dissekera sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellhandtaget </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td> alternativt dissekera verktyg </td></tr><tr><td> Böjda skalpellblad # 12 </td><td> Fin vetenskapVerktyg </td><td> 10.012-00 </td><td> alternativt dissekera verktyg </td></tr><tr><td> Bone sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16.044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutur kopplingsförbehåll tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 00.272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS pincett - vinklad </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Flätad silkessutur storlek 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Medicinska tejpen </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketaminhydroklorid 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Slutliga dosen är 80 mg / kg </td></tr><tr><td> TranquiVed injektion (xylazin 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Slutliga dosen är 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reaktiv Orange 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Ringers lösning Komponenter </td><td></td><td></td><td> Lösning är gas i jämvikt med 95% O 2 och 5% CO 2, slutligt pH 7,4 </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Slutkoncentration: 118 mM </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Slutkoncentration: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Kalciumkloriddihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Slutkoncentration: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Monobasiskt kaliumfosfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Slutkoncentration: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Slutkoncentration: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hydroxietyl) rörrazine-1-etansulfonsyra (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Slutkoncentration: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Slutkoncentration: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Avgörande för bedömningen av potentiella läkemedel för muskelsjukdom är känsliga och reproducerbara fysiologiska bedömningar av muskelfunktion. Eftersom många prekliniska studier är beroende av musmodeller för dessa sjukdomar har isolerad muskelfunktion blivit en av standarderna för Go / NoGo beslut att flytta läkemedelskandidater framåt i patienter. Vi kommer att visa utarbetandet av extensor digitorum longus (EDL) och muskler membran för funktionstestning, som är de dominerande muskler som används för dessa studier. EDL muskel geometri är idealisk för isolerade muskel preparat, med två lättåtkomliga senor, och en liten storlek som kan stödjas av superfusion i ett bad. Membranet uppvisar djup progressiv patologi i dystrofa djur och kan fungera som en plattform för att utvärdera många potentiella behandlingar att motverka fibros och främja myofiber stabilitet. Protokoll för rutinmässig testning, inklusive isometrisk och eccenTRIC sammandragningar, kommer att visas. Isometrisk styrka ger bedömning av styrka och excentriska kontraktioner hjälper att utvärdera sarcolemma stabilitet, vilket störs i många typer av muskeldystrofi. Jämförelser av de förväntade resultaten mellan muskler från vildtyp och dystrofisk muskler kommer också att ges. Dessa åtgärder kan komplettera morfologiska och biokemiska mätningar av vävnad homeostas samt hela bedömningar djur av muskelfunktion.

Förväntade värden för isometriska krafter EDL muskler från 12 veckor gamla djur visas i Figur 1. Eftersom mdx muskler uppvisar kompensatorisk hypertrofi kan totalt tetanic kraft vara högre i MDX muskler jämfört med åldersmatchade vildtyp kontroller. Men en mer lämplig åtgärd för funktionell effekt specifik kraft (figur 2), där kraften normaliseras för tvärsnittsarea för att beräkna detta värde. Specifik kraft beror på den inneboende funktionsförmåga muskeln, där den svaga dystrofa musklerna är mer uppenbar när både absoluta kraft och tvärsnittsarea redovisas. I våra händer, EDL muskler från mdx möss genererar cirka 20 till 25% lägre specifika styrkor än ålder matchade vild typ möss 10 till 26 veckors ålder. För membranet, är endast specifik kraft relevant för jämförelser eftersom preparatet är en bit av muskeln beroende disseInsatser. Jämförelse av specifik kraft mellan vildtyp och mdx muskler membran återspeglar den progressiva patologi i denna vävnad. Isometrisk styrka utgång avtar med åldern (figur 3), så att vid 6 månaders ålder, membran muskler från mdx möss producerar inte mer än hälften av den funktionella produktion av membran remsor från åldersmatchade vildtyp kontroller. Ett exempel på excentriska sammandragningar från membran testning visas i figur 4. Med varje efterföljande excentrisk kontraktion, minskar kraften ut i membranet remsor från både vildtyp (C57) och mdx möss. Emellertid, är förlusten av kraft mer dramatisk i muskelprover från mdx mus, förmodligen från frånvaron av dystrofin och dess associerade proteiner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figur 1. Isometrisk tetanic kraft i vildtyp och mdx EDL muskler f<html> ROM 12 veckor gamla möss. Absolut kraft kan vara högre i åldersmatchade mdx EDL muskler på grund av kompensatorisk hypertrofi. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figur 2. Isometrisk tetanic kraft normaliseras genom muskel tvärsnittsarea är specifik kraft, och avslöjar deprimerad funktionsförmåga EDL muskler från mdx möss jämfört med dem i vildtyp möss. Spår är från samma möss som i figur 1. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figur 3. Den progressiva förlusten av kraft produktionskapacitet bedöms av specifika styrka är tydligast i membranet av mdx möss (röda staplar) jämfört med vildtyp (C57 i blå linje). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. Förlusten av kraft som funktion av excentrisk kontraktion nummer för membran muskler från 12 veckor gamla C57 och mdx möss. Data medelvärde ± SEM för n = 4 muskler per genotyp.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Muskelfunktion mätningar bidrar till utvärderingen av potentiella läkemedel för muskel patologi, samt fastställande av mekanismerna bakom fysiologi av denna vävnad. Vi kommer att visa utarbetandet av extensor digitorum longus och muskler membran för funktionstestning. Protokoll för isometriska och excentriska kontraktioner visas, liksom skillnader i resultat mellan dystrofa muskler, som representerar ett patologiskt tillstånd, och vildtyp muskler.

Isometrisk och excentrisk styrkebidragsprocessen Bedömning av muskler isolerat från musmodeller av muskeldystrofi

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Identifiera mål om mänskliga mikroRNA med lightswitch luciferas analyssystem med 3&#39;UTR-reporter Konstruerar och ett mikroRNA Mimic i Vidhäftande Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

Den Ex vivo Isolerad Skeletal mikrokärlsbildning Förberedelse för undersökning av vaskulär reaktivitet

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Vävnads Triage och frysning efter Modeller av skelettmuskulatur Sjukdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Kontraktilitet Mätningar på isolerade papillarmusklerna för utredning av Cardiac inotropi hos möss

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design och utveckling av aptamer-guld nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser för in-the-fältet Program

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Mätning av insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade mogna skelettmuskler från möss

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...