Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Het plasmide pCG001 uiten Ubp1 werd vriendelijk door Rohan Baker op de John Curtin School of Medical Research. Dit werk werd gefinancierd door March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 en NSF LOOPBAAN award 0.746.796.

1. Strain engineering Workflow <ol><li> Plaats sequenties coderen (a) een membraan lokalisatiesequentie, (b) een snelle rijping fluorescent eiwit en (c) een protease herkenningssequentie N-terminaal en in frame met een eiwit van interesse (bijvoorbeeld een transcriptiefactor). We gebruikten het membraan gerichte Tsr-reporter Venus 2 en gefuseerd aan de protease herkenningssequentie Ubiquitin (Ub) het aantal uitgedrukt bacteriofaag λ repressor CI eiwitmoleculen tellen. Details over hoe construeerde...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

De CoTrAC methode kan worden gegeneraliseerd tot de productie van andere eiwitten waar conventionele N-of C-terminale fusies kunnen fluorescent eiwit proteïneactiviteit verstoren meten. De CoTrAC strategie heeft drie unieke voordelen ten opzichte van de huidige methoden. Eerste co-translationele fusie, zodat een molecuul van de fluorescente reporter geproduceerd voor elk molecuul van het eiwit van belang, zodat nauwkeurige telling van eiwitproductie in real time. Anderzijds de membraan gerichte reporter Tsr-Venus maakt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Agarose (Lage smelttemperatuur) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 x M9 zouten </td><td></td><td></td><td> Volgende recept beschreven in 9 </td></tr><tr><td> 20% glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x MEM aminozuuroplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuur-gecontroleerde groeiKamer Stage-adapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Doelstelling Heater </td><td> Bioptechs </td><td> Model afhankelijk microscoopobjectief </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Schuif </td><td> Bioptechs </td><td> 130.119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro dekglaasjes </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kan moeilijk zijn bron, ook verkrijgbaar bij Bioptechs </td></tr><tr><td> Cover glas / slide pakking </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Divers </td><td> Voorbeeld setup: Coherente Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscoop, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 objectieve, Metamorph software </td><td> Moet laser excitatie, geautomatiseerde xyz stadium, automatisering software in staat om scripted beeldvorming en autofocus, optica staat resolving een enkele fluorescente eiwitten </td></tr><tr><td> EM-CCD Camera </td><td> Divers </td><td> Voorbeeld setup: Andor Ixon DU-898 </td><td> Moet voldoende lage ruis aan een fluorescerende eiwitten boven de achtergrond te detecteren </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC) het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal tellen eiwitmoleculen geproduceerd in een cel gedurende opeenvolgende vijf minuten tijdvensters. Het vereist een fluorescentiemicroscoop met laserexcitatie vermogensdichtheid van ~ 0,5 tot 1 kW / cm 2, die voldoende gevoelig enkele fluorescerende eiwit moleculen te detecteren in levende cellen. De fluorescerende reporter in deze methode bestaat uit drie delen: een membraan doelsequentie, een snel rijpen, geel fluorescerend eiwit en protease herkenningssequentie. De reporter wordt translationeel gefuseerd aan de N-terminus van een eiwit van interesse. Cellen worden gekweekt op een temperatuurgeregelde microscooptafel. Elke vijf minuten worden fluorescerende moleculen in cellen belicht (en later counted door analyse fluorescentiebeelden) en vervolgens photobleached zodat alleen nieuw vertaalde eiwitten geteld in de volgende meting. Fluorescentiebeelden gevolg van deze methode kan worden geanalyseerd door het detecteren van fluorescerende vlekken in elk beeld, het toekennen aan individuele cellen en toewijzen cellen cellijnen. Het aantal eiwitten die binnen een tijdvenster in een bepaalde cel wordt berekend door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van de spots gemiddelde intensiteit van enkele fluorescerende moleculen. We gebruikten deze methode om expressie te meten in het bereik van 0-45 moleculen in enkele 5 min tijdvensters. Deze methode ons in staat om ruis te meten in de expressie van de repressor CI λ, en vele andere mogelijke toepassingen in systeembiologie.

Typische resultaten van een experiment CoTrAC volgen van de productie van het repressor CI λ zijn weergegeven in figuren 4 en 5. In dit experiment werden 12 kolonies afgebeeld op 5 min intervallen. Op elk tijdstip, werd de kolonie eerste autofocused en gecentraliseerd binnen de beeldvorming regio. Vervolgens werd het gecentreerde / gefocuste positie opgeslagen en een helderveld beeld werd verworven. De fase werd translocatie van ~ 0,5 pm langs de z-as van het helderveld brandpuntsvlak ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI volgen<sup&gt; 1</sup&gt;.

Single-molecule Imaging van genregulatie<em&gt; In vivo</em&gt; Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...