Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
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Das Plasmid pCG001 Ausdruck UBP1 wurde freundlicherweise von Rohan Baker an der John Curtin School of Medical Research. Diese Arbeit wurde von March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 und NSF CAREER Award 0.746.796 finanziert.

Ein. Belastung Engineering Workflow <ol><li> Legen Sequenzen kodiert (a) eine Membran-Lokalisierungssequenz, (b) eine schnell reifenden fluoreszierendes Protein und (c) eine Protease-Erkennungssequenz N-terminal zu und im Leserahmen mit einem Protein von Interesse (zB ein Transkriptionsfaktor). Wir verwendeten die Membran gezielt Tsr-Venus Reporter 2 und fusioniert an die Protease Erkennungssequenz Ubiquitin (Ub), die Anzahl der Bakteriophage λ ausgedrückt Repressor CI Proteinmoleküle zählen. E...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Die CoTrAC Verfahren kann verallgemeinert werden, um die Produktion von anderen Proteinen, wo herkömmliche N-oder C-terminale Fusionen fluoreszierendes Protein-Protein-Aktivität zerstören kann messen. Die CoTrAC Strategie hat drei einzigartige Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Erstens sorgt co-translationale Fusion, daß ein Molekül des fluoreszierenden Reporter für jedes Molekül des Proteins von Interesse hergestellt wird, was eine genaue Zählung der Proteinproduktion in Echtzeit. Zweitens die Membra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Agarose (Low Schmelztemperatur) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q-H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9-Salze </td><td></td><td></td><td> Folgende Rezept in 9 beschrieben </td></tr><tr><td> 20% Glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM Aminosäurelösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur-Controlled GrowthKammer Tischadapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Ziel Heater </td><td> Bioptechs </td><td> Modell hängt Mikroskopobjektiv </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kann schwierig sein Quelle; ebenfalls erhältlich von Bioptechs </td></tr><tr><td> Deckglas / slide Dichtung </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Coherent Innova 308C Argon-Ionen-Laser, Olympus IX-81 Mikroskop Olympus PlanApo 100X NA 1,45 Ziel, Metamorph-Software </td><td> Muss Laseranregung, automatisierte xyz Bühne, Automatisierungs-Software in der Lage ist scripted Bildgebung und Autofokus, Optik in der Lage Resolvin habeng einzelner fluoreszierender Proteine </td></tr><tr><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Andor Ixon DU-898 </td><td> Muss niedrig genug Lärm haben, einzelne fluoreszierende Proteine ​​über den Hintergrund erkennen </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren macht es möglich, die Zahl der Proteinmoleküle in einer Zelle während sequentiell, fünfminütigen Zeitfenster produziert zählen. Es erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit Laseranregung Leistungsdichte von ~ 0,5 bis 1 kW / cm 2, die empfindlich genug, um einzelne Moleküle fluoreszierende Protein in lebenden Zellen nachzuweisen ist. Das fluoreszierende Reporter in diesem Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Teilen: eine Membran-Targeting-Sequenz, eine Fast-Reifung, gelb fluoreszierendes Protein und ein Protease-Erkennungssequenz. Der Reporter translatorisch an den N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist. Zellen werden auf einer Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch gewachsen. Alle fünf Minuten werden fluoreszierende Moleküle in Zellen abgebildet (und später coUNTED durch die Analyse von Fluoreszenz-Bildern) und anschließend Lichtgeschädigte so dass nur neu übersetzt Proteine ​​in der nächsten Messung gezählt. Fluoreszenzbilder aus diesem Verfahren kann durch Erfassen Fluoreszenzpunkte in jedem Bild, ihre Zuordnung zu einzelnen Zellen und dann Zuweisen Zellen Zelllinien analysiert werden. Die Anzahl von Proteinen innerhalb eines Zeitfensters in einer gegebenen Zelle erzeugt wird durch Dividieren der integrierten Intensität der Fluoreszenz von Flecken durch die durchschnittliche Intensität der einzelnen fluoreszierenden Moleküle berechnet. Wir verwendeten diese Methode zum Expressionslevel in dem Bereich von 0-45 Molekülen in einzelnen Zeitfenstern 5 min zu messen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, Rauschen in dem die Expression des λ-Repressor CI messen, und hat viele andere potentielle Anwendungen in Systembiologie.

Typische Ergebnisse aus einem Versuch CoTrAC Verfolgen der Herstellung des λ-Repressor CI sind in den 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 12 Kolonien in 5 min Intervallen abgebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurde die erste Kolonie autofocused und zentralisiert innerhalb der Bildgebungsregion. Als nächstes wurde die mittig / fokussierte Position gespeichert und ein Hellfeld Bild erworben wurde. Die Stufe wurde dann von ~ 0,5 um entlang der z-Achse von der translozi...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen<sup&gt; 1</sup&gt;.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Forschung

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration der proteolytischen Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) durch Kombination von Strommessungen mit Nachweis der Spaltfragmente

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...