Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Il pCG001 plasmide che esprime Ubp1 è stato gentilmente fornito da Rohan Baker presso la John Curtin School of Medical Research. Questo lavoro è stato finanziato dal March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Research Scholar Award Starter N ° 5-FY20 e di aggiudicazione CARRIERA NSF 0746796.

1. Flusso di lavoro Strain Ingegneria <ol><li> Inserire codifica sequenze (a) una membrana-localizzazione sequenza, (b) una rapida maturazione proteina fluorescente e (c) una sequenza di riconoscimento proteasi N-terminale e in frame con una proteina di interesse (ad esempio, un fattore di trascrizione). Abbiamo usato la membrana mirata Tsr-Venus 2 giornalista e fuso alla sequenza di riconoscimento proteasi ubiquitina (Ub) per contare il numero di espresse batteriofago λ repressore molecole protei...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Il metodo CoTrAC può essere generalizzato per misurare la produzione di altre proteine ​​con N-convenzionali o C-terminali fusioni proteine ​​fluorescenti possono alterare l&#39;attività della proteina. La strategia CoTrAC ha tre vantaggi unici rispetto ai metodi attuali. First, co-traslazionale fusione assicura che una molecola del reporter fluorescente viene prodotta per ogni molecola di proteina di interesse, permettendo conteggio preciso della produzione di proteina in tempo reale. In secondo luogo, la mem...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Agarosio (bassa temperatura di fusione) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sali M9 </td><td></td><td></td><td> Ricetta seguito descritto in 9 </td></tr><tr><td> 20% di glucosio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM soluzione di aminoacidi </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controllata di crescitaCamera Fase adattatore </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldatore Obiettivo </td><td> Bioptechs </td><td> Modello dipende obiettivo microscopio </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct diapositiva </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto Micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Può essere difficile da fonte, disponibile anche da Bioptechs </td></tr><tr><td> Copertura in vetro / slide guarnizione </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 millimetri </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Vario </td><td> Esempio di installazione: Coherent Innova 308C Argon-laser a ioni, Olympus IX-81 microscopio, Olympus Planapo 100X NA 1,45 obiettivo, software Metamorph </td><td> Deve avere eccitazione del laser, automatizzato fase xyz, software di automazione in grado di imaging script e autofocus, ottica in grado di resolving singole proteine ​​fluorescenti </td></tr><tr><td> EM-CCD </td><td> Vario </td><td> Esempio di installazione: Andor Ixon DU-898 </td><td> Deve avere rumore sufficientemente basso per rilevare singole proteine ​​fluorescenti sopra sfondo </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC) per l&#39;immagine della produzione di molecole di proteine ​​in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo permette di contare il numero di molecole di proteine ​​prodotte in una cella durante sequenziali, cinque minuti finestre temporali. Si richiede un microscopio a fluorescenza con densità di potenza laser di eccitazione di ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, che è sufficientemente sensibile per rivelare singole molecole di proteine ​​fluorescenti in cellule vive. Il reporter fluorescente utilizzata in questo metodo si compone di tre parti: una sequenza di targeting membrana, una rapida maturazione, proteina fluorescente gialla e una sequenza di riconoscimento proteasi. Il reporter è traduzionalmente fusa all&#39;N-terminale di una proteina di interesse. Le cellule vengono coltivate su un temperatura controllata portaoggetti. Ogni cinque minuti, le molecole fluorescenti all&#39;interno delle cellule vengono esposte (e poi counted analizzando le immagini di fluorescenza) e, successivamente, in modo che le proteine ​​photobleached solo appena tradotti sono conteggiati nella misura successiva. Immagini di fluorescenza risultanti da tale metodo può essere analizzato rilevando macchie fluorescenti in ogni immagine, assegnando loro singole celle e quindi assegnare cellule per linee cellulari. Il numero di proteine ​​prodotte entro una finestra temporale in una data cella è calcolato dividendo l&#39;intensità di fluorescenza delle macchie integrato per l&#39;intensità media di singole molecole fluorescenti. Abbiamo usato questo metodo per misurare i livelli di espressione nella gamma di 0-45 molecole in finestre singole 5 min di tempo. Questo metodo consente di misurare il rumore nell&#39;espressione del repressore λ CI, e ha molte altre applicazioni potenziali in biologia dei sistemi.

Risultati tipici di un esperimento CoTrAC tracciamento della produzione del repressore λ CI sono mostrati nelle Figure 4 e 5. In questo esperimento, sono stati ripresi 12 colonie a intervalli di 5 min. Ad ogni punto di tempo, la colonia fu autofocused e centralizzato all&#39;interno della regione di imaging. Successivamente, l&#39;centrato / focalizzato posizione è stata memorizzata e l&#39;immagine è stata acquisita campo chiaro. Lo stadio è stato poi traslocato da ~ 0,5 micron lun...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC), per l&#39;immagine della produzione di molecole di proteine ​​in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo è stato utilizzato per seguire la dinamica stocastica espressione di un fattore di trascrizione, il repressore λ CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

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