Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
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Ubp1を発現するプラスミドpCG001は、親切に医学研究のジョン·カーティン学校でロハンベイカーによって提供されました。この作品は、ダイム研究助成1〜2011年度の3月ダイムバジルオコナースターター客員研究賞＃5-FY20とNSFキャリアアワード0746796の行進によって賄われていた。

1。ひずみエンジニアリングワークフロー<ol><li>シーケンスのエンコード（）の膜局在化配列、（b）の高速成熟蛍光タンパク質とすると、目的のタンパク質（ 例えば転写因子）とフレーム内の（c）にプロテアーゼ認識配列のN末端 ​​。を挿入我々は、TSR-金星レポーター2標的膜を使用し、発現バクテリオファージλリプレッサーCIのタンパク質分子の数をカウントするユビキ...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

CoTrAC方法は、従来のN末端またはC末端蛍光タンパク質融合体がタンパク質活性を妨害する可能性のある他のタンパク質の産生を測定することが一般化することができる。 CoTrAC戦略は、現在の方法に比べて3特有の利点があります。まず、共同翻訳融合は蛍光レポーターの1分子がリアルタイムでタンパク質生産の正確なカウントを可能にする、目的のタンパク質の各分子のために生成されるこ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>アガロース（低融解温度） </td><td>ロンザ</td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td>のMilli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5×M9塩</td><td></td><td></td><td>以下のレシピは9に記載</td></tr><tr><td> 20％グルコース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50×MEMアミノ酸溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td>温度制御成長室 ステージアダプタ</td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td>客観ヒーター</td><td> Bioptechs </td><td>モデルは、顕微鏡の対物レンズに依存</td><td></td></tr><tr><td>スライドをMicroaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119から5 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td>ソースが困難な場合があります。Bioptechsからも利用可能</td></tr><tr><td>ガラス/スライドガスケットをカバー</td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0.75ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>さまざまな</td><td>セットアップ例：コヒーレントイノーバ308Cアルゴンイオンレーザー、オリンパスIX-81顕微鏡、オリンパスPlanApo 100X NA 1.45客観、Metamorphソフトウェア</td><td>レーザー励起、自動XYZステージ、スクリプト化されたイメージングとオートフォーカスが可能な自動化ソフトウェア、resolvinことのできる光学系を持っている必要がありますgシングル蛍光タンパク質</td></tr><tr><td> EM-CCDカメラ</td><td>さまざまな</td><td>セットアップ例：アンドールIXON DU-898 </td><td>バックグラウンドを超える単一の蛍光タンパク質を検出するために十分に低いノイズを持っている必要があります</td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm 2のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列：このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子（およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted）、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。 この方法から得られた蛍光画像は、各画像の蛍光スポットを検出し、個々のセルに割り当てること、その後の細胞系譜への細胞を割り当てることによって分析することができます。与えられたセルにタイムウィンドウ内で産生される蛋白質の数は、単一蛍光分子の平均強度によってスポットの統合された蛍光強度を割ることによって計算されます。我々は、単一の5分の時間ウィンドウで0から45分子の範囲内で発現レベルを測定するために、このメソッドを使用していました。この方法は、私たちがλリプレッサーCIの式で騒音を測定するために有効になっており、システム生物学の他の多くの潜在的なアプリケーションを持っています。

λリプレッサーCIの生産を追跡CoTrAC実験から得られた典型的な結果を図4および図5に示されている。この実験では、12個のコロニーは、5分間隔で撮像した。各時点で、コロニーは最初autofocusedたと撮像領域内の中央。次に、フォーカス/中心位置が格納されていたと明視野画像を取得した。ステージはその後細胞（位相差または微分干渉コントラスト（DIC）光学系なし2?...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています<sup&gt; 1</sup&gt;。

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

切断断片の検出と電流測定を組み合わせることにより、上皮性ナトリウムチャネル（ENaCの）のタンパク質分解活性の実証

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

1分子FRETによるDNAループを研究

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...