Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Plasmidet pCG001 uttrykke Ubp1 ble vennlig levert av Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Dette arbeidet ble finansiert av March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 og NSF KARRIERE award 0.746.796.

1. Strain Engineering arbeidsflyt <ol><li> Sett sekvenser koding (a) en membran-lokalisering sekvens, (b) en rask modning fluorescerende protein og (c) en protease gjenkjennelsessekvens N-terminal til og i ramme med et protein av interesse (f.eks en transkripsjonsfaktor). Vi brukte membranen målrettet TSR-Venus reporter 2 og smeltet det til protease gjenkjennelsessekvens Ubiquitin (UB) for å telle antall uttrykt bakteriofag λ repressor CI protein molekyler. Detaljer om hvordan vi konstruerte fus...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Den CoTrAC metoden kan bli generalisert til måle produksjonen av andre proteiner hvor konvensjonelle N-eller C-terminale fluorescerende protein fusjoner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unike fordeler fremfor dagens metoder. Først sikrer co-translasjonell fusjon som ett molekyl av den fluorescerende reporter produseres for hvert molekyl av proteinet av interesse, slik at nøyaktig telling av proteinproduksjon i sanntid. Sekund, membran målrettede reporter TSR-Venus gjør single-molekyl dete...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Agarose (Lav smeltetemperatur) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9 salter </td><td></td><td></td><td> Følgende oppskrift beskrevet i 9 </td></tr><tr><td> 20% glukose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSo4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM aminosyreløsning </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur-kontrollert vekstChamber Stage adapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Målet Heater </td><td> Bioptechs </td><td> Modellen er avhengig av mikroskop mål </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro dekke briller </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kan være vanskelig å kilde, også tilgjengelig fra Bioptechs </td></tr><tr><td> Dekke glass / slide pakning </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescens mikroskop </td><td> Various </td><td> Eksempel oppsett: Samstemt Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 mikroskop, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 mål, MetaMorph programvare </td><td> Må ha laser eksitasjon, automatisert xyz scenen, automatisering programvare kan manus bildebehandling og autofokus, optikk som kan resolving enkle fluorescerende proteiner </td></tr><tr><td> EM-CCD kamera </td><td> Various </td><td> Eksempel oppsett: Andor Ixon DU-898 </td><td> Må ha tilstrekkelig lav støy å oppdage enkle fluorescerende proteiner over bakgrunnen </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) til bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden gjør det mulig å telle antallet av proteinmolekyler produsert en celle under sekvensielle, fem minutters tidsvinduer. Det krever en fluorescensmikroskop med laser magnetisering effekttetthet ~ 0,5 til 1 kW / cm 2, som er tilstrekkelig følsom til å detektere enkelt fluorescerende proteinmolekyler i levende celler. Den fluorescerende reporter brukes i denne metoden består av tre deler: en membran målretting sekvens, en rask modning, gul fluorescerende protein og en protease gjenkjennelsessekvens. Reporteren er translationally smeltet til N-terminus av et protein av interesse. Celler dyrkes på en temperatur-kontrollert mikroskop scenen. Hvert femte minutt, er fluorescerende molekyler i cellene avbildes (og senere counted ved å analysere fluorescens bilder) og deretter photobleached slik at bare nylig oversatte proteiner telles i neste måling. Fluorescens bilder som følge av denne metoden kan analyseres ved å registrere fluorescerende flekker i hvert bilde, tildele dem til individuelle celler og deretter tildele celler til celle linjene. Antallet proteiner produsert innenfor et tidsvindu i en gitt celle er beregnet ved å dividere den integrerte fluorescensintensiteten av flekker med gjennomsnittlig intensitet av enkelt fluorescerende molekyler. Vi brukte denne metoden for å måle uttrykket nivåer i størrelsesorden 0-45 molekyler i enkle 5 min tidsvinduer. Denne metoden mulig for oss å måle støy i uttrykket av λ repressor CI, og har mange andre potensielle bruksområder i systembiologi.

Typiske resultater fra en CoTrAC eksperiment sporing produksjonen av λ repressor CI er vist i figurene 4 og 5. I dette eksperimentet ble 12 kolonier avbildes på 5 min intervaller. Ved hvert tidspunkt, ble kolonien første autofocused og sentraliserte innenfor bildebehandling regionen. Deretter ble sentrert / fokusert posisjon lagres og en lysfelt bildet ble kjøpt. Scenen ble deretter translocated av ~ 0,5 mikrometer langs z-aksen for å flytte fra lysfelt fokusplan til flyet halverer...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) i bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden har blitt brukt til å følge de stokastiske uttrykk dynamikken i en transkripsjon faktor, λ repressor CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation<em&gt; In vivo</em&gt; Ved hjelp av Cotranslational Aktivering av Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstrasjon av Proteolytisk Aktivering av epithelial natriumkanalen (ENaC) ved å kombinere strømmålinger med Detection cleavage Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studerer DNA Looping av Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallell høy gjennomstrømning enkelt molekyl kinetisk analyse for stedsspesifikk DNA cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...