Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Plasmiden pCG001 uttrycker Ubp1 tillhandahölls vänligen av Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Detta arbete har finansierats av March of Dimes forskningsbidrag 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 och NSF KARRIÄR utmärkelse 0.746.796.

1. Stam Engineering arbetsflöde <ol><li> Infoga sekvenser som kodar (a) en membran-lokaliseringssekvens, (b) en snabbt mognande fluorescerande protein och (c) ett proteas igenkänningssekvens N-terminalt till och i ram med ett protein av intresse (t.ex. en transkriptionsfaktor). Vi använde membranet riktade TSR-Venus reporter 2 och fuserades den till proteas igenkänningssekvensen Ubiquitin (Ub) för att räkna antalet uttryckta bakteriofag λ repressormolekyler CI proteinmolekyler. Detaljer om h...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Den CoTrAC metoden kan generaliseras för att mäta produktionen av andra proteiner där konventionella N-eller C-terminala fusioner fluorescerande protein kan störa proteinaktivitet. Den CoTrAC Strategin har tre unika fördelar jämfört med dagens metoder. Först säkerställer sam-translationella fusion som en molekyl av den fluorescerande reporter framställs för varje molekyl av proteinet av intresse, vilket möjliggör noggrann räkning av proteinproduktion i realtid. För det andra membran-riktade reportern TSR...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Agaros (låg smälttemperatur) </td><td> Lonza </td><td> 50.100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q-H-2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9-salter </td><td></td><td></td><td> Följande recept beskrivet i 9 </td></tr><tr><td> 20% glukos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaClj 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM aminosyralösning </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur-kontrollerad tillväxtKammare Steg-adapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv Värmare </td><td> Bioptechs </td><td> Modell beror på mikroskopobjektiv </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro täckglas </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kan vara svårt att köpa, också tillgänglig från Bioptechs </td></tr><tr><td> Omslag glas / bild packning </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop </td><td> Olika </td><td> Exempel inställning: Coherent Innova 308C argonjonlaser, Olympus IX-81 mikroskop, Olympus PlanApo 100X NA 1,45 mål, Metamorph programvara </td><td> Måste ha laserexcitation, automatiserad xyz skede automations mjukvara kan manus avbildning och autofokus, optik kan resolving single fluorescerande proteiner </td></tr><tr><td> EM-CCD-kamera </td><td> Olika </td><td> Exempel setup: Andor IXON DU-898 </td><td> Måste ha tillräckligt låg ljudnivå för att upptäcka enstaka fluorescerande proteiner över bakgrunden </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC) att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod gör det möjligt att räkna antalet proteinmolekyler som produceras i en cell under sekventiella, fem minuters tidsfönster. Det kräver ett fluorescensmikroskop med laserexcitation effekttäthet ~ 0,5 till 1 kW / cm 2, vilket är tillräckligt känslig för att detektera enstaka fluorescerande proteinmolekyler i levande celler. Den fluorescerande reporter användes i denna metod består av tre delar: ett membran målsekvens, en snabbt mognande, gult fluorescerande protein och ett proteas-igenkänningssekvens. Reportern är translationellt fuserad till N-terminalen av ett protein av intresse. Celler odlas på en temperaturstyrd mikroskop scenen. Var femte minut, är fluorescerande molekyler i celler avbildas (och senare counted genom att analysera fluorescens bilder) och därefter photobleached så att endast nya översatta proteiner räknas i nästa mätning. Fluorescensbilder följd av denna metod kan analyseras genom att detektera fluorescerande fläckar i varje bild, tilldela dem till enskilda celler och därefter tilldela celler till cellinjer. Antalet proteiner producerade inom ett tidsfönster i en given cell beräknas genom att dividera den integrerade fluorescensintensiteten av fläckar med den genomsnittliga intensiteten av enstaka fluorescerande molekyler. Vi använde denna metod för att mäta uttrycksnivåer i intervallet 0-45 molekyler i enstaka 5 fönster min tid. Denna metod gjorde det möjligt att mäta buller i uttryck av λ repressorn CI, och har många andra potentiella tillämpningar i systembiologi.

Typiska resultat från en CoTrAC försök spåra produktionen av λ repressorn Cl visas i figurerna 4 och 5. I detta experiment, var 12 kolonier avbildas vid 5 min intervaller. Vid varje tidpunkt, var kolonin 1:e autofocused och centraliseras inom bildbehandling regionen. Därefter var centrerade / fokuserad läge lagras och en brightfield bild förvärvades. Scenen därefter translokeras genom ~ 0,5 um längs z-axeln för att röra sig från brightfield fokalplanet till planet skär ce...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC), att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod har använts för att följa de stokastiska expressions dynamiken i en transkriptionsfaktor, den λ repressorn CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Enda molekyl avbildning av genreglering<em&gt; In vivo</em&gt; Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Enda molekyl avbildning av kärntransport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration av Proteolytic Aktivering av Epithelial Natrium Channel (ENaC) genom att kombinera Aktuella Mätningar med detektion av klyvningsfragment

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Parallell hög genomströmning Single Molecule Kinetic assay för Site-specifika DNA-klyvning

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...