Name: single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Ubp1 ifade plazmid pCG001 nazik Tıbbi Araştırma John Curtin Okulu&#39;nda Rohan Baker tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Dimes Araştırma Bursu 1-FY2011 Mart Dimes, Basil O&#39;Connor Başlangıç ​​Akademik Araştırma Ödülü # 5-FY20 ve NSF KARİYER Ödülü 0.746.796 Mart tarafından finanse edildi.

1. Gerinim Mühendislik İş Akışı <ol><li> Dizileri kodlama (a) bir zar-yerelleştirme dizisi, (b) bir hızla olgunlaşan floresan protein ve bir ilgi ve protein (örneğin, bir transkripsiyon faktörü) ile çerçeve (c) bir proteaz tanıma sekansı, N-terminalinde. Ekleme Biz Tsr-Venüs muhabiri 2 hedef membran kullanılan ve ifade bakteriyofaj λ repressör CI protein moleküllerinin sayısını saymak için Ubikitin proteaz tanıma dizisi (Ub) için erimiş. Biz bölgenin kodlama CI yabani ...

<ol>
	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

CoTrAC yöntemi geleneksel N-veya C-terminali floresan proteini füzyon proteini etkinliği bozabilir diğer proteinlerin üretimini ölçmek için yaygın olabilir. CoTrAC stratejisi mevcut yöntemler üzerinde üç benzersiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, eş-translasyonel füzyon flüoresan raportör molekülü, gerçek zamanlı olarak protein üretim doğru sayımı izin veren, ilgilenilen proteinin her bir molekül için üretilmiş olmasını sağlar. İkincisi, membran hedefli muhabiri Tsr-Venüs çok düşü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Agaroz (Düşük erime sıcaklığı) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H2O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 x M9 tuzlan </td><td></td><td></td><td> Aşağıda tarif 9&#39;da tarif edildiği gibi </td></tr><tr><td> % 20 glikoz </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x MEM amino asit solüsyonu </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrollü BüyümeBölme Sahne adaptörü </td><td> Bioptechs </td><td> -2 FCS </td><td></td></tr><tr><td> Amaç Isıtıcı </td><td> Bioptechs </td><td> Model mikroskop objektif bağlıdır </td><td></td></tr><tr><td> Slayt Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro kapağı gözlük </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kaynağı zor olabilir; Bioptechs adresinden de bulunabilir </td></tr><tr><td> Cam / slayt conta Kapak </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Tutarlı Innova 308C Argon iyon lazer, Olympus IX-81 mikroskop, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 hedefi, Metamorph yazılım </td><td> Lazer uyarma, otomatik xyz aşamasında, komut dosyası görüntüleme ve otofokus yeteneğine otomasyon yazılımı, resolvin yeteneğine optik olmalıg tek floresan proteinleri </td></tr><tr><td> EM-CCD Kamera </td><td> Çeşitli </td><td> Örnek kurulum: Andor Ixon DU-898 </td><td> Arka plan üstüne tek floresan proteinleri tespit etmek için yeterince düşük gürültü olmalı </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC) proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bu mümkün ardışık beş dakikalık bir zaman pencereleri sırasında bir hücre tarafından üretilen protein moleküllerinin sayısını saymak mümkün kılar. Bu canlı hücrelerde tek floresan protein molekülleri tespit etmek için yeterince hassas olan ~ 0,5 1 kW / cm 2, lazer uyarma güç yoğunluğuna sahip bir floresan mikroskop gerektirir. Bir zar hedefleme sırası, bir hızlı-olgunlaşma, sarı floresan protein ve bir proteaz tanıma sekansı: bu yöntemde kullanılan flüoresan raportör üç parçadan oluşur. Raportör Çevrimsel ilgi çeken bir proteinin N-terminusunda için eritilerek birleştirilir. Hücreler bir sıcaklık kontrollü mikroskop sahnede yetiştirilir. Her beş dakikada, hücrelerin içindeki floresan molekülü (ve daha sonra eş görüntülü) floresans görüntüleri analiz ederek unted ve sadece yeni tercüme proteinler sonraki ölçüm sayılan böylece sonradan photobleached. Bu yöntem sonucunda floresans görüntüler, her bir görüntü floresan noktalar tespit tek hücreleri atayarak ve ardından hücre soylarının hücreleri atayarak analiz edilebilir. Belirli bir hücreye bir zaman penceresi içinde üretilen proteinlerin sayısı tek flüoresan moleküllerinin ortalama yoğunluk tarafından lekelerin entegre floresan yoğunluğu bölünmesiyle hesaplanır. Bu tek bir 5 dakikalık bir zaman pencereleri içinde 0-45 molekül aralığında ifade seviyelerini ölçmek için bu yöntem kullanılır. Bu yöntem bize λ repressör CI ifadesi gürültü ölçmek için etkin ve sistem biyolojisi diğer birçok potansiyel uygulamalar vardır.

Λ repressör CI üretim takip bir CoTrAC deneyden elde Tipik sonuçlar Şekiller 4 ve 5 &#39;de gösterilmiştir. Bu deneyde, 12 koloniler 5 dakika aralıklarla görüntülenmiştir. Her zaman noktasında, koloni birinci autofocused edildi ve görüntüleme bölge içinde merkezi. Sonraki odaklı / merkezli pozisyonu saklanan ve aydınlık görüntü elde edildi. Evresi hücrelerin (faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik olmadan bisecting düzlemine aydınlık oda...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC at JoVE.com

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC), proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bir transkripsiyon faktörü, λ repressör CI stokastik ifade dinamik takip etmek için kullanılmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...