Name: live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag GM096076 från NIH AREA programmet.

1. Förbereda Flugor för Dissection <ol><li> Söva friska flugor av den önskade genotypen (t.ex. uttrycker en GFP-märkt protein) som är mindre än en vecka gammal. Välj 10-15 stora honor med rundade gräddfärgade bakkroppen. </li><li> Överför valda flugor och några (3-5) män till en flaska innehållande ny lätt yeasted mat och låta flugorna att göda under två dagar vid 25 ° C. Se Weil et al. 6 för information om Drosophila beredning. Gödning flugorna gör att en mängd steg, speciellt stegen 8-12, kommer att finnas tillgänglig för avbildning. Dåligt göds eller unfattened flyger innehåller vanligtvis endast mycket tidiga stadier (1-6) och mogna (steg 14) oocyter. </li></ol> 2. Framställning av Oocyter för avbildning med en Upprätt förening Mikroskop <ol><li> Förbered en standard glasskiva genom att fästa två täckglas till bilden, ca 1 cm från varandra, med hjälp av silikon grease. Använd endast tillräckligt fett för att säkerställa en god tätning mellan täckglas och objektglas. Trycka ordentligt på var och täckglaset sprider fettet tunt och jämnt. Lägg till lite Halocarbon Oil 27 (Sigma) till övergången mellan täckglasen och bildspel. De kommer att fungera som distanser för att förhindra skada isolerade oocyter i efterföljande steg. Nej 1,5 täckglas fungerar bra, med en genomsnittlig tjocklek (0,16 till 0,18 mm) som matchar sent stadium oocyter. </li><li> Placera 2-3 droppar Halocarbon Oil 27 på ytan av en 22 mm 2 täckglas. För att få de mest hälsosamma oocyter möjligt görs en individuell kvinna ur maten injektionsflaskan med Munpipettering och försiktigt deponeras i halogenkolvätet oljan utan att först söva. </li><li> Använda vassa dissekera pincett (som Dumont # 5), stift flugan mot täckglas och dra av spetsen på buken. Avlägsna äggstockarna genom att dra dem längs ytan av täckglaset, under oljan. Detta kommer att främja adhesion av oocyter till täckglaset. </li><li> Försiktigt retas isär äggstockarna, leta efter oocyter som åtminstone skede 10B oogenes. Oocyter i detta skede kan identifieras genom att leta efter ägg kammare där oocyten upptar minst 50-60% av den totala volymen av ägget kammaren. Vid denna punkt i oogenes har follikelceller överliggande äggcellen blir kolumner och omger äggcellen på alla sidor utom en liten region där anslutningar till sjuksköterska cellerna kvar. Använd pincett för att avlägsna enskilda oocyter från ovariole manteln. </li><li> Fortsätt genom att använda 1-3 honor, tills 5-8 oskadade oocyter har isolerats på täckglaset. Ta bort alla unuseable vävnad. </li><li> Försiktigt invertera täckglaset innehållande oocyter på den förberedda bilden så att oocyterna är placerade mellan de två distansorganen. Tryck inte ner den inverterade täckglas som skadar oocyter. Om det behövs, tillsätt en liten mängd halogenkolväte olja till than kanter &quot;sandwich&quot; för att säkerställa att utrymmet fylls. (Valfritt:. Låt bilden vila under flera minuter för att tillåta sedimentering av täckglas) Bilden är nu klar för avbildning. </li></ol> 3. Beredning av Oocyter för avbildning med en inverterad sammansatt mikroskop <ol><li> Oocyter dissekeras huvudsakligen som beskrivs i avsnitt 2, förutom att små petriskålar med ett glas botten insats (Mattek, 35 mm) används istället för täckglas. Det är onödigt att täcka provet, och efter dissektion kan vävnad avbildas direkt i rätter, men man måste vara uppmärksam för att säkerställa att oocyter förblir täckt med olja och får inte torka ut. </li></ol> 4. Realtidsundersökningen <ol><li> Ta en oocyt i fokus med DIC eller fas optik kontrast och undersöka äggcellen för eventuella skador, till exempel läckage av cytoplasma eller utbuktning av follikelceller. Endast bild oocyter som visas friska och oskadade. </li><li> Streaming kan övervakas direkt utan behov för GFP märkning, eftersom äggula vesiklar i cytoplasman är autofluorescerande 7. Denna signal kan fångas i FITC intervallet omfattningen men kommer sannolikt att kräva större förstärkning inställningar än de som används för GFP-märkta proteiner. </li><li> De bästa bilderna av streaming erhålls från optiska delar som är strax under ytan av oocyten som vilar mot täckglas / Petri glas. Här äggcellen är något tillplattad, vilket leder till en bättre plan fokus. Bilder kan tas vid 200X - 1.000 X. Använda arrangemanget som beskrivs här, bör luft mål skall användas, eftersom täckglas bildar en barriär mellan äggcellen och objektiv. Detta är optimalt eftersom det i hög grad minimerar avdrift och rörelse av provet. </li><li> När ett område av intresse är i fokus, stäng av brighfield optik och byta till konfokal avbildning. Använda snabb skanning / förhandsvisning funktion av programvaran, justera fokus och fåbehov. </li><li> Inställningar för infångning varierar från mikroskop till mikroskop, men allmänna parametrar är följande: Använd en excitationsvåglängd av ~ 488 nm och en emissionsvåglängd av ~ 515 nm. Ställ in Z-axeln fånga så att Z-axeln förblir konstant, med en eftersläpning på 10 sekunder mellan bilderna. Fånga en testsekvens av 5-10 ramar för att säkerställa att oocyten är stationär och fokalplanet är lämpligt. </li><li> En typisk tid förflutit sekvens kommer att fånga mellan 20 - 50 bildrutor, och kan ses omedelbart efter att bedöma videokvalitet. Processen kan upprepas för andra celler i sliden, eller ytterligare honor kan dissekeras behov. </li></ol> 5. Felsökning och vanliga problem <ol><li> Drift - När du använder en upprätt mikroskop, kan celler ibland driva på grund av spridning av olja. Detta kan minimeras genom att använda endast tillräckligt med olja för att täcka området under täckglaset. Om problemen kvarstår, använder mindre silikon grease att anbringa distanser till bilden. </li></ol> Obs! Vissa konfokala programvaror tillåter cell spårning, men i allmänhet är det bättre att överge avbildning av drivande oocyter och istället använda ett annat provexemplar. <ol start="2"><li> Inga tecken på streaming - Om streaming inte är uppenbart, är det förmodligen på en av två orsaker, antingen fokalplanet för Bildinsamling inte är korrekt (vanligtvis för djupt i det inre av äggcellen) eller ägget är skadad. Tid och praktik kan minimera båda fel. </li></ol>

<ol>
	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

Jag har inget att lämna ut.

Drosophila oocyter är ett mångsidigt modellsystem för adressering olika frågor som rör funktion och organisation av celler och subcellulära komponenter. En fullständig förståelse av proteiners funktion kräver övervakning av både rumsliga och tidsmässiga aspekter av protein beteende. Framsteg inom både bildsystem och genetiska verktyg som finns för Drosophilists gör det möjligt även för små laboratorier för att utföra hög experiment bildkvalitet i levande oocyter. Här har jag beskriva ett protokoll för att analysera beteendet hos GFP-märkta eller autofluorescerande proteiner och strukturer under mitten till slutet-oogenes som kan användas tillsammans med en mängd genetiska bakgrunder för att undersöka proteiners funktion. I detta protokoll beskriver jag den process genom vilken äggceller är förberedda för avbildning och de grundläggande konfokala inställningar som gör det möjligt förvärv av time lapse video av fluorescerande proteiner och strukturer. Ytterligare DetaiÄr på oocyt framställning beskrivs av Weil et al. Ett brett utbud av flyga stammar som uttrycker proteiner som har endogent taggade via exon-svällning är tillgängliga 8, och oändligt mycket mer protein varianter kan konstrueras och återinföras till flugor 6. I arbetet med levande vävnad, är hälsa proverna av största vikt. Egg kammare från steg 10B kan fylla oogenes i ett väsentligen oberoende sätt 11, vilket gör dem idealiska för kortsiktiga imaging studier. Man måste vara försiktig vid flera viktiga steg för att få högkvalitativa data. Vid dissektion är det viktigt att manipulera äggstockar och oocyter så lite som möjligt, och för att minimera mängden tid mellan dissektion och slutförandet av avbildning. Helst ska en liten dissektion station placerad i samma rum som rymmer konfokala omfattning och endast ett fåtal ägg kammare i taget bör avbildas. Antalet rekommenderas här (5-8) Ser till att dissektion minimeras samtidigt som man maximerar sannolikheten att erhålla god kvalitet bilder. Jag rekommenderar att fånga en kort serie bilder för att bedöma bildkvalitet och bekräfta att fotograferingsinställningarna optimeras, innan du tar en längre sekvens tid förflutit. De flesta program tillåter enskilda bildrutor som ska sparas och dessa bilder kan sedan analyseras på olika sätt med hjälp av ImageJ 12 eller annan programvara.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Halocarbon Oil 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF Tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Silikonfett </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Glas-botten Petriskålar </td><td> Mattek </td><td> P35G-0-20-C- </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

Drosophila äggcellen har etablerats som ett mångsidigt system för att utreda grundläggande frågor såsom cytoskelett funktion, cell organisation och organell struktur och funktion. Tillgången på olika GFP-märkta proteiner innebär att många cellulära processer kan övervakas i levande celler under loppet av minuter eller timmar, och med hjälp av denna teknik har processer såsom RNP transporter, epitelial morfogenes och vävnadsombildning beskrivits i detalj i Drosophila oocyter 1,2. Förmågan att utföra videobildhanteringsutrustning kombinerat med en rik repertoar av mutanter möjliggör en enorm variation av gener och processer som ska undersökas i otrolig detaljrikedom. Ett sådant exempel är processen att ooplasmic streaming, som initierar vid mitten oogenes 3,4. Denna kraftiga rörelse av cytoplasmiska blåsor är mikrotubuli och kinesin beroende 5 och ger en bra systemTEM för att utreda cytoskelett funktion på dessa stadier. Här presenterar jag ett protokoll för tiden lapse avbildning av levande oocyter med praktiskt taget alla konfokalmikroskopi inställningar.

Avbildning av GFP-märkta proteiner kommer att variera beroende på hur starkt det märkta proteinet uttrycks. En utvärdering efter halva steg oocyt uttrycker reticulon-liknande 1 (Rtnl-1), exon taggade med GFP 8,9 producerar stark signal. Rtnl-1 verkar tillsammans lokalisera de långa mikrotubuli närvarande under ooplasmic streaming 10 (Figur 1A). Rtnl-1 är en bra markör för att observera strömmande, och är också en indikator på mikrotubuli organisation sent stadium oocyter. Ooplasmic streaming i en vildtyp ägg kammare är uppenbart så märkbar rörelse autofluorescerande äggula vesiklar vid användning av en fångst hastighet av en ram var 10 sek (Figur 1B). En maximal projektion av fem bildrutor kan genereras för att markera väg rörliga blåsor. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Figur 1. Realtidsundersökningen av både autofluorescent och GFP-märkta strukturer. A) En enda time-lapse bild av en scen 11 oocyt uttrycker Rtnl1-GFP vid 400X. Rtnl1-GFP fibrer rör sig med en vågliknande rörelse i strömmande oocyter. B) En fem ram maximal projektion av ett steg 10B ägg kammare i vilken autofluorescerande äggula vesiklarna avbildades varje 10 sek för 50 sek totalt, vid 400X förstoring. Skala bar = 30 | im

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes at JoVE.com

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Ett protokoll för levande avbildning av GFP-märkta proteiner eller autofluorescerande strukturer i enskilda<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter beskrivs.

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Live avbildning av gliacellsmarkörer migration i Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Beredningen av Drosophila Embryon för Live-Imaging Använda droppe protokollet

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Beredning av Utveckla och vuxna Drosophila Brains och retinae för Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Framställning av individuella Drosophila Egg Chambers för Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...