Name: quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

תמיכת גרנט: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ קונג), NIH CA150197S1 (ע&quot;א Changou), מרכז-0,120,999 PHY NSF Biophotonics מדע וטכנולוגיה (DL וולפסון, FYS צ&#39;ואנג), DOD PC073420 (RJ מודגש), המחקר המועצה של נורבגיה, Leiv Eiriksson מסעות גרנט 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ קונג גם מכיר בתמיכת קרן אובורן קהילת סרטן הקרן. RJ מודגש גם מכיר את תמיכתה של מקדונלד &#39;ס י הקדש. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ני ויי-ג&#39;ן קונג וד&quot;ר בור ון וו בDesigneRx לאספקה ​​נדיבה של עדי.

1. חלק 1: תא תרבות וסימון חיסוני ניאון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול CWR22 RV1 תאים סרטניים בערמונית אדם על זכוכית coverslips (# 1.5 או עובי מיקרומטר 170) הוצב ב6 גם צלחות, עם RPMI (מדיאטק, VA) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין. </...

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

תוך ההתבוננות הישירה של תאים שכותרתו עם בדיקות ניאון נגד LC3 מקובל כשיטת סטנדרטית כדי לאשר תגובת autophagic 6, ההדמיה 3D הכמותי של אותה המערכת (כפי שעשינו) מספק מידע ופירוט חסר תקדים על התהליך המורכב של הסלולר autophagy . בפרט, אנו צופים כי מאות (אם לא אלפי) של autophagosomes בתאים חי...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

סרטן הערמונית הוא הצורה המובילה של גידולים ממאירים בקרב גברים בארצות הברית בזמן ניתוח טומן בחובו סיכון משמעותי של חוסר אונים וחוסר שליטה, מסורתיים כימותרפיות גישות היו במידה רבה, לא הצליחו. טיפול הורמונלי הוא יעיל בשלב מוקדם, אבל לעתים קרובות לא מצליח עם ההתפתחות העתידית של גידולי הורמון עקשן. אנחנו כבר מתעניין בפיתוח תרופות למיקוד חסר מטבולי מסוימים של תאים סרטניים. לאחרונה הראינו כי תאים סרטניים בערמונית במיוחד חסרי אנזים (synthase argininosuccinate, או ASS) המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו ארגינין 1. מצב זה גורם לתאים הסרטניים להיות תלוי בארגינין אקסוגני, והם עוברים לחץ מטבולי כאשר ארגינין החופשי תיגמר ידי ארגינין deiminase (ADI) 1,10. ואכן, יש לנו הראינו כי תאי ערמונית סרטניים אנושיים CWR22 RV1 נהרגים ביעילות על ידי עדי באפופטוזיס caspase-עצמאי וautopha האגרסיביGY (או macroautophagy) 1,2,3. Autophagy היא תהליך שימור אבולוציונית-המאפשר לתאים כדי לעכל חלבונים לא רצויים על ידי התמוטטות lysosomal במהלך רעב תזונתי 4,5. למרות המרכיבים החיוניים של מסלול זה הם מאופיינים היטב 6,7,8,9, היבטים רבים של המנגנון המולקולרי עדיין אינם ברורים - בפרט, מהו תפקידיו של autophagy במותו בתגובה של תאי סרטן ערמונית לאחר טיפול ADI ? על מנת לענות על שאלה זו, אנו נדרשים שיטת ניסוי כדי למדוד את הרמה וההיקף של תגובת autophagic בתאים - ומכיוון שאין סמנים מולקולריים ידועים במדויק יכול לעקוב אחר תהליך זה, בחרנו לפתח גישה מבוססת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופיה 11,12. הקרינה 3D כמותית שימוש בתאים CWR22Rv1 במיוחד שכותרתו עם בדיקות ניאון לautophagosomes וlysosomes, אנו מראים כי ערימות תמונת 3D רכשו עם או wiמיקרוסקופיה deconvolution defield (ומאוחר יותר, עם סופר רזולוציה, מיקרוסקופיה מובנה תאורה) יכולה ללכוד באופן ברור בשלבים הראשונים של האינדוקציה autophagy. עם יישומי ניתוח תמונה דיגיטליים זמינים מסחרי, אנחנו יכולים בקלות להשיג מידע סטטיסטי על מספר autophagosome ויזוזום, גודל, הפצה, ומידה מסוימת של colocalization מכל תא הדמיה. מידע זה מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של autophagy בתאים חיים דווקא ומאפשר המשך החקירה שלנו לתוך התפקיד של autophagy בטיפול כימותרפי.

רצף התמונות שמוצג באיור 1 מציג את השינויים הפיסיים המתרחשים בתאים במהלך CWR22 80 דקות הראשונה של האינדוקציה autophagy. בזה ומחקרים אחרים (לא מוצג) באופן עקבי ציינו: (1) תזוזה של הגרעין ממרכז התא; (2) הפחתה של נקודות מוקד הדבקה, וכן (3) טרנסלוקציה הכללית של autophagosomes וlysosomes ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

תיקון דיוק גבוה של שינויים כרומטית תלת-ממדיים בגיל הדמיה ביולוגית סופר ברזולוציה באמצעות כרומעגנון

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...