Name: quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Grant stöd: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Centrum för Biophotonics Science &amp; Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ fet), The Research Norges, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkänner också stöd från Auburn Community Cancer Donationsfond. RJ Bold erkänner också stöd av J. McDonald kapitalförsäkring. Vi tackar Dr Jenny Wei-Jen Kung och Dr Bor-wen Wu vid DesigneRx för generöst utbud av ADI.

Ett. Del 1: Cell Culture och Immuno-fluorescensmärkning <ol><li> Grow CWR22 RV1 humana prostatatumörceller på glas täckglas (# 1,5 eller 170 | im tjocklek) placerades i 6-brunnars plattor, med RPMI (Mediatech, VA) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin / glutamin. </li><li> Framkalla autophagy genom att behandla utvalda proverna med arginindeiminas (ADI, 0,3 | ig / ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). </li><li> Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA, Fisher Scienti...

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

Medan den direkta observationen av celler märkta med fluorescerande prober mot LC3 är allmänt accepterat som en standardmetod för att bekräfta autophagic svar 6, kvantitativ 3D avbildning av samma system (som vi har gjort) ger oöverträffad information och detaljer om den komplexa processen av cellulära autophagy . Framför allt märker vi att hundratals (om inte tusentals) av autophagosomes i levande celler bildas inom 80 min av autophagy induktion. Likaså ser vi mycket intressanta morfologiska för?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Prostatacancer är den ledande formen av maligniteter bland män i USA Medan operation medför en betydande risk för impotens och inkontinens, har traditionella kemoterapeutiska metoder tappat målet. Hormonbehandling är effektiv på tidigt stadium, men ofta misslyckas med en eventuell utveckling av hormonrefraktär tumörer. Vi har varit intresserade av att utveckla läkemedel som riktar sig specifikt metabolisk brist på tumörceller. Vi visade nyligen att prostatatumörceller specifikt saknar ett enzym (argininosuccinat syntas eller ASS) involverade i syntesen av aminosyran arginin 1. Detta tillstånd orsakar tumörcellerna att bli beroende av exogen arginin, och de genomgår metabolisk stress då fri arginin är uttömda av arginindeiminas (ADI) 1,10. Vi har faktiskt visat att humana prostatacancerceller CWR22 RV1 effektivt dödas av ADI med kaspas-oberoende apoptos och aggressiv autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy är en evolutionärt bevarad process som gör att celler att metabolisera oönskade proteiner genom lysosomal nedbrytning under näringsmässiga svält 4,5. Även de viktigaste komponenterna i denna väg är väl karaktäriserade 6,7,8,9, många aspekter av den molekylära mekanismen är fortfarande oklar - i synnerhet, vad är rollen av autophagy i döden-respons av prostatacancerceller efter ADI behandling ? För att ta itu med denna fråga, krävs vi en experimentell metod för att mäta nivån och omfattningen av autophagic respons i celler - och eftersom det inte finns några kända molekylära markörer som exakt kan spåra denna process, valde vi att utveckla en avbildning synsätt, med kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12. Använda CWR22Rv1 celler specifikt märkta med fluorescerande prober för autophagosomes och lysosomer, visar vi att 3D bildstaplar förvärvats med antingen widefield deconvolution mikroskopi (och senare, med super-upplösning, strukturerad-belysning mikroskopi) kan tydligt fånga de tidiga stadierna av autophagy induktion. Med kommersiellt tillgängliga digitala applikationer bildanalys, kan vi få lätt statistisk information om autophagosome och lysosome antal, storlek, fördelning, och graden av colocalization från någon avbildade cell. Denna information ger oss möjlighet att exakt följa utvecklingen av autophagy i levande celler och möjliggör vår fortsatta utredning in i rollen av autophagy i cancer kemoterapi.

Bilden som visas i figur 1 visar de fysiska förändringar som sker i CWR22-celler under den första 80 min av autophagy induktion. I denna och andra studier (ej visad) vi observerade genomgående: (1) förskjutning av kärnan bort från cellens centrum, (2) reduktion av fokala vidhäftning punkter, och (3) allmänna translokering av autophagosomes och lysosomer mot centrum av den cell. Dessutom noterade vi också en liten ökning av colocalization (anges i gult) mellan autophagosomes (grön) och lysoso...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Autophagy är en allestädes närvarande process som gör det möjligt för celler att brytas ned och återvinna proteiner och organeller. Vi tillämpar avancerad fluorescens mikroskopi för att visualisera och kvantifiera små, men viktiga, fysiska förändringar i samband med framkallande av autophagy, däribland bildandet och distribution av autophagosomes och lysosomer, och deras fusion i autolysosomes.

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Visualisering Singel molekylkomplex In Vivo Använda avancerade fluorescensmikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection (Video) | JoVE

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast (Video) | JoVE

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy (Video) | JoVE

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images (Video) | JoVE

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Analys av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Identifiering av Kinesin-1 Cargos Använda fluorescensmikroskopi

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Funktionell avbildning av Viral transkription fabriker använder 3D fluorescensmikroskopi

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon (Video) | JoVE

Hög noggrannhet korrigering av 3D kromatiska förändringar i en ålder av super-resolution biologisk avbildning med chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...