Name: quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Hibe desteği: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), Biophotonics Bilim ve Teknoloji (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Kalın) için NSF FİZ-0.120.999 Merkezi, Araştırma Norveç Konseyi, Leiv Eiriksson Seyahat Bursu 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung de Auburn Topluluk Kanser Vakfı Fonu&#39;nun desteğiyle kabul eder. RJ Kalın da J. McDonald bağış desteği kabul eder. Biz ADI cömert temini için Dr Jenny Wei-Jen Kung ve DesigneRx Dr Bor-wen Wu teşekkür ederim.

1. Bölüm 1: Hücre Kültürü ve Immuno-floresan Etiketleme <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / glutamin ihtiva eden RPMI (Mediatech, VA) ile 6-delikli plakalardaki yerleştirilen cam lamelleri (# 1.5 ve 170 mikron kalınlığında) ilgili RV1 CWR22 insan prostat tümörü hücrelerinin büyümesini. </li><li> Fosfat tamponlu salin (PBS) arginin deiminaz (ADI, 0.3 ug / ml) ile muamele etmek suretiyle seçilmiş örnekler Otofaji neden olur. </li><li> Oda sıcaklığın...

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

LC3 karşı floresan problar ile işaretli hücrelerin doğrudan gözlem yaygın otofajik yanıt 6, nicel 3D aynı sistem (yaptığımız gibi) görüntüleme hücresel otofaji karmaşık süreci hakkında benzeri görülmemiş bir bilgi ve ayrıntı sağlayan onaylamak için standart bir yöntem olarak kabul edilirken . Özellikle, canlı hücrelerde autophagosomes yüzlerce (yoksa bin) otofaji indüksiyon 80 dakika içinde oluşur görüyoruz. Benzer şekilde, otofaji indüksiyon sırasında lizozomal bölm...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Cerrahi iktidarsızlık ve inkontinans önemli bir risk taşır iken Prostat kanseri ABD&#39;de erkekler arasında malignite önde gelen biçimidir, geleneksel kemoterapötik yaklaşımların büyük ölçüde başarısız olmuştur. Hormon tedavisi erken bir aşamada etkilidir, ancak genellikle hormon dirençli tümörlerin nihai gelişimi ile başarısız olur. Biz tümör hücrelerinin belirli metabolik eksikliği hedefleyen tedavi gelişmekte ilgi var. Yakın zamanda bu prostat tümör hücrelerinin, özellikle amino asit arginin 1 sentezinde yer alan bir enzim (argininosükinat sintaz veya ASS) eksikliği göstermiştir. Bu durum dışsal arjinin bağımlı hale için tümör hücrelerinin neden olur, ve ücretsiz arjinin arjinin deiminaz (ADI) 1,10 ile bittiği zaman metabolik stres tabi. Gerçekten de, insan prostat kanseri hücrelerinde CWR22 RV1 etkili kaspaz-bağımsız apoptoz ve agresif autopha ile ADI tarafından öldürüldü olduğunu göstermiştirgy (veya macroautophagy) 1,2,3. Otofaji hücreleri 4,5 beslenme açlık sırasında lizozomal arıza istenmeyen proteinleri metabolize sağlayan bir evrimsel-korunmuş bir süreçtir. Bu yolun temel bileşenleri 6,7,8,9 iyi karakterize olmasına rağmen, moleküler mekanizmasının birçok açıdan hala belirsiz - özellikle, ADI tedavi sonrası prostat kanseri hücrelerinin ölümüne-yanıt olarak otofaji rolü nedir ? Bu soruya cevap verebilmek için, biz hücrelerinde otofajik cevap düzeyi ve kapsamı ölçmek için deneysel bir yöntem gerekli - ve doğru bu süreci takip edebilirsiniz bilinen bir moleküler işaretleri olduğu için, biz kullanarak, bir görüntüleme-temelli bir yaklaşım geliştirmek için seçti nicel 3D floresan mikroskobu 11,12. Autophagosomes ve lizozomlar için floresan problar ile özel etiketli CWR22Rv1 hücreleri kullanarak, 3D görüntü yığınlarının wi ya ile elde olduğunu göstermektedirdefield deconvolution mikroskobu (ve daha sonra, süper çözünürlük, yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu ile) açıkça otofaji indüksiyon erken aşamalarında yakalayabilir. Piyasada bulunan dijital görüntü analizi uygulamaları ile, kolayca autophagosome ve lizozom sayısı, boyutu, dağılımı ve herhangi bir görüntülü hücreden ko derecesi hakkında istatistiksel bilgi alabilirsiniz. Bu bilgiler tam olarak canlı hücrelerin içinde otofaji ilerleme izlemenize olanak sağlayan ve kanser kemoterapi otofaji rolüne devam eden soruşturma sağlar.

Şekil 1 &#39;de gösterilen görüntü dizisi Otofaji oluşumunun ilk 80 dakika boyunca CWR22 hücrelerinde meydana gelen fiziksel değişiklikleri gösterir. Bu ve diğer çalışmalar (gösterilmemiştir) sürekli olarak gözlenen: uzak hücre merkezine çekirdeğin (1) değiştirme; odak yapışma noktaları (2) azaltılması ve ortasına doğru autophagosomes ve lizozomlar (3) Genel translokasyon Celi. Buna ek olarak, biz de daha sonra noktalarında autophagosomes (yeşil) ve lizozomlar (kırmızı...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection (Video) | JoVE

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast (Video) | JoVE

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy (Video) | JoVE

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images (Video) | JoVE

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon (Video) | JoVE

Chromagnon Kullanarak Süper Çözünürlüklü Biyolojik Görüntüleme Çağında 3D Kromatik Değişimlerin Yüksek Doğrulukdüzeltmesi

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...