Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

גרנט: 5RO1GM086447-02.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תקשורת LB עם מושבה בודדה של זן JB281 [BW25113 / pJB042 (P אק: FtsZ-mEos2)]. לגדול בלילה שייקר על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את תרבות 1:1,000 לM9 + תקשורת מינימאליים [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 מ&quot;מ, 4 MgSO 0.1 ...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

תמונות PALM מכילות מידע אודות ספירת מולקולה ועמדות בתוך תא, המאפשרים ניתוח מפורט של החלוקה והסידור של מולקולות חלבון המטרה שקשה להשיג באמצעים אחרים. להלן מתארים אמצעי זהירות שיש לנקוט כדי לחלץ מידע כמוני מדויק תוך שמירה על רלוונטיות הביולוגיות של תמונות PALM. אנחנו גם ל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 50 x MEM חומצות אמינו </td><td> סיגמא </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM ויטמינים </td><td> סיגמא </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> אלקטרוני מדעי Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 חרוזי זהב ננומטר </td><td> Microspheres-nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 הדמיה קאמרית </td><td> BIOPTECHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתאם שלב </td><td> אסי </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך </td><td> אולימפוס </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, מטרת 60x </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מצלמת iXon EMCCD </td><td> תידור טכנולוגיה </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ליזר CUBE 405 ננומטר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

חלוקת תא חיידק דורשת הרכבה המתואמת של יותר מעשרה חלבונים חיוניים בmidcell 1,2. מרכזי לתהליך זה הוא ההיווצרות של suprastructure דמוי טבעת (Z-טבעת) על ידי חלבון FtsZ בתכנית חלוקת 3,4. Z-הטבעת מורכבת מprotofilaments FtsZ היחיד תקוע המרובים, וההבנה שההסדר של protofilaments בתוך Z-הטבעת תספק תובנה לתוך המנגנון של הרכבת Z-טבעת ותפקודו כמחולל כוח 5,6. מידע זה נותר חמקמק בשל מגבלות נוכחיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי אינו יכול לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של Z-הטבעת בשל גבול השתברות אור (~ 200 ננומטר). אלקטרוני cryotomographic הדמיה זיהתה מפוזרת protofilaments FtsZ בג הקטן תאי crescentus 7, אבל קשה ליישם לתאים גדולים יותר כגוןחיידק או B. subtilis. כאן אנו מתארים את היישום של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוצית סופר, מיקרוסקופי לוקליזציה Photoactivated (PALM), כדי לאפיין כמותית הארגון המבני של ה coli Z-טבעת 8. PALM הדמיה מציעה היא ברזולוציה מרחבית גבוהה (~ 35 ננומטר) וסימון ספציפי כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של חלבוני היעד. אנחנו מתויגים FtsZ עם mEos2 photoactivatable ניאון החלבון, אשר עובר מהירוק פלואורסצנטי (עירור = 488 ננומטר) לאדום פלואורסצנטי (עירור = 561 ננומטר) עם הפעלה ב405 ננומטר 9. במהלך ניסוי PALM,-mEos2 FtsZ מולקולות בודדות מופעלות stochastically ועמדות centroid המקבילות המולקולות הבודדות נקבעות עם &lt;דיוק ננומטר 20. תמונה ברזולוצית סופר של Z-טבעת אז שוחזר על ידי superimposing את העמדות של כל centroid-mEos2 FtsZ המולקולות זוהו. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; שימוש בשיטה זו, מצאה כי Z-הטבעת יש רוחב קבוע של ~ 100 ננומטר והוא מורכב מצרור רופף של protofilaments FtsZ חופפים זה לזה בשלושה ממדים. נתונים אלה מספקים קרש קפיצה לחקירות נוספות של השינויים התלויים מחזור התא של Z-10 הטבעת ויכולים להיות מיושמים לחלבונים אחרים של עניין.

באיור 3Aiv הוא עיבוד דו ממדים, ברזולוצית הסופר של Z-הטבעת שנוצרה משיטת הדמית PALM שתוארה לעיל. להלן אבקש לסכם מידע איכותי וכמוני, שניתן להשיג אותם. איכותי, ראה שZ-הטבעת היא מבנה לא סדיר, המאמץ תצורות מרובות (להקה יחידה או קשת סל?...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

תיקון דיוק גבוה של שינויים כרומטית תלת-ממדיים בגיל הדמיה ביולוגית סופר ברזולוציה באמצעות כרומעגנון

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

זמן הדמיה של נחילים חיידקיים ואת תגובת הלחץ הקולקטיבי

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...