Name: super-resolution imaging of the bacterial division machinery
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00
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グラント：5RO1GM086447-02。

1。試料調製<ol><li>ひずみJB281の単一コロニーをLB培地に接種[BW25113 / pJB042（P ラック ：FtsZ-mEos2）]。 37℃で振とう機で一晩増殖℃、 </li><li> M9 +最少培地[M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO 4を 、0.1 mMのCaCl 2、MEMアミノ酸やビタミン]に文化1:1,000希釈し、中期対数期（OD 600 = 0.2から0.3）に成長室温（RT）でクロラムフェニコール（150μg/ ml）をプレゼンスイン?...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

PALMのイメージは、他の手段によって達成することは困難である標的タンパク質分子の分布および配置の詳細な分析を可能にする、セル内の分子数と位置に関する情報が含まれています。以下では、PALM画像の生物学的関連性を維持しながら、正確な定量的情報を抽出するために取られるべきである注意事項を概説しています。我々はまた、最高のライブ対固定された細胞を用いて得ることが?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 50×MEMアミノ酸</td><td>シグマ</td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100×MEMビタミン</td><td>シグマ</td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>メディアテック</td><td> 46から102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td>電子Micrsocopyサイエンス</td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTGアガロース</td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50nmのゴールドビーズ</td><td>ミクロス-ナノスフェア</td><td> 790113-010 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2イメージング商工会議所</td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージアダプター</td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NAは、60倍対物</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCDカメラ</td><td>アンドール·テクノロジー</td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488 nmのサファイアレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561 nmのサファイアレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405 nmのCUBEのレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

細菌の細胞分裂がmidcell 1,2で10以上必須タンパク質の協調アセンブリが必要です。このプロセスの中心には、分割計画3,4においてFtsZタンパク質によるリング状の上部構造（Z-リング）の形成である。 Z-リングは、複数の一本鎖FtsZのプロトフィラメントで構成されており、Z-リングの内側プロトフィラメントの配置を理解する力発生器5,6のように、Z-リングアセンブリとその機能のメカニズムへの洞察を提供します。この情報は、従来の蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で起因する電流制限にとらえどころのない推移している。従来の蛍光顕微鏡は、光の回折限界（〜200 nm）に起因し、Z-リングの高解像度の画像を提供することができません。電子cryotomographicイメージングは小さなCに散在FtsZのプロトフィラメントが検出されましたcrescentusセル 7が、そのようなのようなより大きなセルに適用することは困難である大腸菌または B 枯草 。ここでは、定量的にEの構造組織を特徴づけるために超解像蛍光顕微鏡法、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）のアプリケーションを記述する大腸菌 、Z-リング8。 PALMイメージングは​​、高空間分解能（〜35 nm）と標的タンパク質の明確な識別を可能にするために、特定のラベルの両方を提供しています。我々は405nmの9時に起動したときに赤色蛍光（励起= 561 nm）に緑色蛍光（励起= 488 nm）から切り替える光活性化蛍光タンパク質mEos2とFtsZのラベルが付いた。やし実験中、シングルFtsZ-mEos2分子は確率的に活性化され、単一分子の対応する重心位置が&lt;20 nmの精度で決定されます。 Z-リングの超解像は、すべての検出されたFtsZ-mEos2分子の重心位置を重ね合わせて再構築さ​​れます。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;この方法を用いて、我々は、Z-リングが〜100nmの固定幅を持っており、三次元的に互いに重ならFtsZのプロトフィラメントの緩い束で構成されていることがわかった。これらのデータは、Z-リング10の細胞周期依存性の変化のさらなる調査のための足がかりを提供し、関心のある他のタンパク質に適用することができます。

図3Aivに示すが、上述のPALMイメージング法から生成Z-リングの二次元、超解像レンダリングです。以下では、私たちがそれらから得られる定性的および定量的な情報を要約したものです。 定性的には、我々は、Z-リング（ 図3A-DIIと iv を比較）従来の蛍光画像では区別できないので、複数の構成（シングルバンドまたはヘ...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。

細菌分裂機械の超解像イメージング

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

クロマニョンを用いた超解像生物学的イメージング時代における3次元色素の高精度補正

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

細菌群のタイムラプスイメージングと集団ストレス応答

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...